BIOLOGIA APPLICATA E BIOTECNOLOGIE AGRARIE

9 DNA e RNA antisenso

Così come è possibile identificare il gene, isolarlo, inserirlo in un batterio perché esprima la proteina a noi utile, è anche possibile riconoscere il gene e disattivarlo o modificarlo selettivamente.
Il metodo consiste nel costruire in laboratorio dei frammenti di DNA costituiti da un piccolo numero di nucleotidi, almeno 1618 basi, detti oligonucleotidi antisenso.
Introdotti nella cellula, gli oligonucleotidi antisenso catturano l’mRNA e si legano ad esso formando zone dette di duplex artificiale o ibrido.
Lo stesso risultato si può avere anche con molecole di RNA dette antisenso, che si legano all’mRNA senso delle quali sono complementari; anche in questo caso si forma una zona di duplex. È il duplex artificiale, che impedisce meccanicamente all’RNA di legarsi al ribosoma. Esso diviene bersaglio di alcuni enzimi, le ribonucleasi (RNAsiH), normalmente presenti nella cellula, che lo riconoscono e lo disintegrano.
Gli oligonucleotidi antisenso, interrompendo la sequenza che consente al gene di esprimersi nella specifica proteina, possono essere utilizzati per fabbricare nuovi farmaci con azione:
-  antivirale, quando la proteina bersaglio è quella del virus essenziale alla sua moltiplicazione;
-  antitumorale, quando la proteina bersaglio è quella essenziale alla crescita delle cellule tumorali.
Dal 1978, quando fu reso noto il primo esperimento, e soprattutto dalla metà degli anni Ottanta, notevole è stato l’interesse per la ricerca di questi nuovi farmaci, ma sono molti gli ostacoli che chimici, virologi, oncologi incontrano e che devono di volta in volta superare.
Finora si sono ottenuti risultati soddisfacenti nell’arrestare lo sviluppo di un virus, il citomegalovirus, che porta alla cecità individui immunodepressi; anche in campo oncologico questi farmaci si sono rivelati efficaci nel curare una forma di leucemia in individui che non avevano risposto positivamente alle cure tradizionali.
Il DNA e l’RNA antisenso vengono utilizzati anche nella produzione di organismi transgenici.





Approfondimenti
Il citomegalovirus (CMV)
>Si tratta di un virus assai comune in grado di infettare persone di tutte le età. Una volta entrato nell’organismo, il virus ci rimane per tutta la vita ma, nella maggior parte dei casi, l’infezione rimane anonima, cioè chi è infetto non presenta alcun sintomo. Tuttavia, il virus può causare anche seri disturbi sia a livello fetale (nelle donne in gravidanza) sia nei pazienti con problemi conclamati di immunodeficienza. Il citomegalovirus appartiene alla famiglia degli Herpesvirus: questa comprende anche i virus dell'Herpes simplex e quelli che causano la varicella e la mononucleosi.
Chiunque può contrarre un’infezione da citomegalovirus, ma nella maggior parte dei casi (adulti e bambini) i sintomi sono di lieve entità. Il contagio può avvenire: tramite contatto interpersonale (baci, rapporti sessuali, contatto con saliva o urina infetta se subito dopo si toccano le mucose degli occhi o dell’interno delle narici); allattamento al seno da parte di una madre infetta; oppure da madre infetta che trasmette il virus al feto durante la gravidanza; trasfusioni e trapianti.


Schematizzazione della struttura di un CMV: glicoproteine di membrana; genoma; capside; parete.

10 Librerie geniche o genoteche

Le librerie geniche sono insiemi di frammenti di DNA ricombinanti, o cloni di essi, provenienti da un certo organismo o tessuto.
Quando una libreria genica contiene, in almeno una copia, tutte le possibili sequenze, si dice che essa è rappresentativa mentre si definisce ridondante se contiene molte copie di alcune sequenze.
Esistono 2 tipi principali di librerie.
1.  Libreria di DNA genomico che rappresenta l’intero genoma (libreria genomica). Essa raccoglie tutti i geni espressi e non, esoniintroni, promotori e altre sequenze di un genoma. È specifica di ogni organismo. Per preparare una library genomica occorre:
- isolare il DNA genomico;
- digerirlo “parzialmente con gli enzimi di restrizione;
-  ligare i frammenti di restrizione in un vettore adatto;
-  trasformare le cellule ospiti con i prodotti di ligazione.
2.  Libreria di cDNA. È ottenuta in un opportuno vettore di clonaggio e deriva dalla conversione dell’mRNAin DNA duplex, utilizzando la trascrittasi inversa. Raccoglie solo sequenze codificanti espresse nel particolare tessuto in particolari condizioni e rappresenta soltanto i geni trascritti. È detta libreria di espressione, costruita in modo che il ceppo ospite sintetizzi la proteina codificata dal gene presente nel frammento eterologo. È specifica del tessuto da cui si è estratto l’RNA.


Procedure per la realizzazione di una libreria genetica.
Per preparare una library di cDNA occorre:
1.  purificare l’RNA dalle cellule;
2.  retrotrascriverlo in cDNA;
3.  ligare i cDNA ottenuti nel vettore adatto;
4.  trasformare le cellule ospiti con i prodotti di ligazione.
Una libreria viene mantenuta sotto forma di plasmi di o di batteri trasformati.
Poiché in una libreria genica di solito i singoli cloni non sono indicizzati e non si sa a quale gene o segmento genomico corrisponde un dato clone, per ottenere questa informazione e ricercare una particolare sequenza fra tutte quelle presenti è necessario effettuare uno screening.
Lo screening può essere:
-  screening immunologico, se analizza la sequenza proteica del clone utilizzando un anticorpo come reagente specifico nei confronti di questa che funge da antigene. Poiché l’anticorpo si combina specificamente con l’antigene, se l’antigene è presente in una o più colonie della piastra, può essere localizzato osservando il legame alLanticorpo che viene evidenziato tramite autoradiografìa, usando lastre per raggi X;
-  screening funzionale, se esamina la funzione biochimica della proteina;
-  screening per interazione, se valuta la capacità di interazione della proteina con altre proteine;
-  screening mediante ibridazione di sonde oligonucleotidiche, se utilizza una sequenza di DNA del clone.
È il metodo più comunemente utilizzato per le analisi di genoteche, in quanto rapido e applicabile a tutti i tipi di librerie.

11 Ibridazione di acidi nucleici

Le tecniche di ibridazione permettono non solo di identificare e quantificare sequenze specifiche di DNA e di RNA, ma di studiarne l’organizzazione, la localizzazione intracellulare e l’espressione. Per determinare la presenza e la quantità di acidi nucleici si usa una sequenza specifica detta sonda molecolare, o probe, corrispondente al DNA bersaglio nel campione biologico analizzato.
Le sonde possono essere corte (2030 oligonucleotidi) o lunghe (23 kb).
Le tecniche di ibridazione consistono nell’appaiamento di molecole a singolo filamento provenienti da due fonti diverse (il DNA bersaglio e la sonda) e permettono di identificare all’interno di un gel i frammenti di DNA che sono complementari a una determinata sequenza.
Innanzitutto il DNA deve subire un processo chiamato denaturazione che consiste nella separazione della molecola di DNA in due filamenti singoli. Questo processo si verifica quando una soluzione acquosa di DNA è riscaldata a 100 °C o esposta a un pH molto alto (>13) o sono presenti sostanze come urea o formamide che rompono i ponti a idrogeno che normalmente tengono insieme i due filamenti della doppia elica.
Poiché la denaturazione è un processo reversibile, se dopo la separazione delle eliche si fa scendere gradualmente la temperatura a 65 °C o si varia il pH, i singoli filamenti si possono riappaiare e la doppia elica può riformarsi. Il processo è chiamato rinaturazione del DNA.
Allo stesso modo si possono avere reazioni anche fra due catene di DNA a singolo filamento di diversa origine, purché abbiano sequenze nucleotidiche complementari e si possano formare delle doppie eliche di DNARNA o RNARNA.
Questo processo prende il nome di ibridazione e il risultato è definito ibrido molecolare. La condizione fondamentale perché ciò avvenga è che in soluzione si mettano molecole di DNA a singolo filamento antiparallele con sequenza complementare, cioè delle sonde. L’ibridazione è una forma di riconoscimento molecolare estremamente specifica e la sonda è in grado di trovare fra moltissime sequenze proprio, e solo, quella complementare.
Le sonde, inoltre, devono essere rilevabili e a tal fine vengono marcate con sostanze fluorescenti o con isotopi radioattivi come zolfo 35 (35S) e fosforo 32 (32P) che sono i più usati in biologia molecolare.


Visualizzazione di eteroduplex sondabersaglio in un saggio di ibridazione di acidi nucleici. Un campione di interesse (consistente in una miscela complessa di acidi nucleici) e una popolazione predefrnita di sonde (costituite da seguenze note di acido nucleico, o oligonucleotidiche allo stato di singolo filamento), vengono miscelati e lasciati appaiare. Le sequenze che in precedenza erano appaiate nel campione di interesse e nella sonda si riappaieranno tra loro per formare omoduplex (in basso a sinistra e a destra). Tuttavia, si formeranno anche nuove molecole di eteroduplex tra la sonda e le sequenze bersaglio che possiedono sequenze totalmente o parzialmente complementari a essa (in basso al centro).
Le condizioni di ibridazione possono essere modificate per facilitare la formazione di eteroduplex. In questo modo, le sonde riconoscono e identificano selettivamente acidi nucleici correlati presenti in una popolazione complessa.

I segnali emessi dai radioisotopi si rilevano attraverso:
1.  la tecnica dell’autoradiografìa, che sfrutta la capacità degli isotopi radioattivi di impressionare le lastre fotografiche;
2.  il contatore geiger, che misura gli ioni prodotti in un gas da particelle p o da raggi y emessi da un radioisotopo;
3.  il contatore a scintillazione, entro il quale un campione radiomarcato è mescolato con un liquido che contiene un liquido fluorescente capace di emettere luce quando assorbe l’energia delle particelle p o dei raggi y durante il decadimento radioattivo.
Esistono anche metodi di marcatura non radioattiva, quali la biotina e la digossigenina, che danno substrati stabili più a lungo e più sicuri per l’operatore.
Si conoscono vari tipi di sonde.
1.  Sonde cromosomaspecifiche. Si tratta di una sonda costituita da un insieme di sonde di DNA, ognuna delle quali è omologa all’intero cromosoma considerato. L’ibridazione con una sonda cromosomaspecifica viene marcata con un fluorocromo per visualizzare segnali fluorescenti su una determinata coppia di cromosomi omologhi lungo tutto il cromosoma.
2.  Sonde centromerospecifiche. Questa sonda è costituita da un tipo di sequenze ripetute, dette alfoidi, presenti nei centromeri. La sua ibridazione marcata con un fluorocromo permette di visualizzare segnali fluorescenti a livello dei centromeri di una coppia di cromosomi omologhi.
3.  Sonde telomerospecifìche. Sono costituite da sequenze localizzate nella parte terminale dei cromosomi e sono sequenze specifiche per il telomero di ogni cromosoma.
L’ibridazione con una sonda telomerica specifica, marcata con un fluorocromo, consente di visualizzare segnali fluorescenti a livello dei telomeri di uno dei due bracci di una coppia di cromosomi omologhi.
4. Sonde locus-specifìche. La sonda locusspecifìca è costituita dalla sequenza di una regione delimitata lungo uno specifico cromosoma e la sua ibridazione, con tale sonda marcata con un fluorocromo, permette di visualizzare segnali fluorescenti a livello di una regione sul braccio corto o sul braccio lungo di una coppia di cromosomi omologhi.
Le sonde di DNA marcate possono essere utilizzate per monitorare su fase solida (membrane di nitrocellulosa, nylon) la presenza in una popolazione eterogenea di uno specifico frammento di DNA (.Southern blotting) o di RNA (Northern blotting) o le proteine (Western blotting).
I frammenti degli acidi nucleici sono trasferiti su gel di agarosio o di poliacrilamide dopo essere stati precedentemente separati tramite elettroforesi.
Il Southern blotting è sfruttato principalmente per analizzare nel dettaglio la struttura di un gene, a partire cioè da pochissime molecole di un campione di DNA genomico.
Il Northern blotting è utilizzato per lo studio dell’espressione genica, cioè per capire quali geni vengono trascritti: l’RNA viene estratto e purificato da cellule o tessuti e poi analizzato per determinare la presenza o assenza di una certa sequenza.
Il Western blotting è una tecnica mediante la quale una molecola, aH’interno di una miscela di proteine separate elettroforeticamente, è successivamente riconosciuta in genere tramite metodi immunologi ci.


Visualizzazione delle diverse sonde muscolari specifi che. Il gialloverde identifica dove viene localizzato il segnale fluorescente dovuto all’ibridazione della sonda sul cromosoma.

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GENETICA, TRASFORMAZIONI, AGROAMBIENTE