BIOLOGIA APPLICATA E BIOTECNOLOGIE AGRARIE

7 Le biotecnologie molecolari

Considerando i vari livelli di organizzazione dei viventi, si può affermare che il livello cellulare manifesta un sottostante livello di organizzazione interna definito molecolare. Lo studio circa la struttura e le relazioni che intercorrono fra le molecole organiche complesse presenti nella cellula è obiettivo primario della biologia molecolare il cui dogma centrale (im geneuna proteina) stabilisce come, nei sistemi biologici, il flusso delle informazioni passi dal DNA all’RNA e da questo alle proteine. Queste molecole hanno dimensioni gigantesche e sono definite macromolecole: esse hanno un ruolo determinante nel regolare tutte le attività della cellula e dell’intero organismo e vengono sintetizzate solo dagli esseri viventi essendo caratterizzate, nella loro composizione chimica, dalla presenza del carbonio (elemento che ha la capacità di instaurare un numero molto elevato di legami chimici).
Una sempre più approfondita conoscenza delle parti elementari e dei modi in cui queste molecole si integrano e si organizzano, nonché dei fattori dell’eredità (cromosomi, geni) e delle loro funzioni nella variabilità genetica che si verifica nel prosieguo delle generazioni, consente di raggiungere risultati sempre più efficienti nei confronti delle attività umane: in ambito sanitario (vaccini più sicuri, medicinali contro disfunzioni metaboliche a base genetica, antitumorali più efficaci e meno dannosi per l’organismo, stimolatori delle difese immunitarie) e agroambientale (sviluppo di metodiche di biomonitoraggio e biorisanamento tramite l’impiego di enzimi e microrganismi procarioti ed eucarioti).


Il livello cellulare è caratterizzato da una sua organizzazione secondo la tipologia di tessuto e funzione svolta: (a) cellule vegetali (foglia di elodea); (b) cellule animali da tessuto muscolare/connettivo; (c) divisione mitotica osservata in cellule di cipolla.

Le modalità d’indagine applicano tecniche che provengono anche da varie altre discipline, quali la biochimica, la fìsica e la genetica e trovano applicazione nell’ingegneria genetica (detta anche tecnologia del DNA ricombinante) e nella biotecnologia molecolare.
Poiché, per gli studi di biologia molecolare, le strumentazioni attuali non riescono a identificare e a utilizzare soltanto poche molecole di DNA, è stata messa a punto (cosa che è di fondamentale importanza) la tecnica della PCR che consente di avere una grande quantità di copie di una molecola dell’acido nucleico.

La reazione a catena della polimerasi

Comunemente nota con l’acronimo PCR, è una tecnica di biologia molecolare che consente la moltiplicazione (amplificazione) di frammenti di acidi nucleici dei quali si conoscano le sequenze nucleotidiche iniziali e terminali.
L’amplificazione mediante PCR consente di ottenere in vitro molto rapidamente la quantità di materiale genetico necessaria per le successive applicazioni. Il processo di amplificazione del DNA avviene in natura per azione di enzimi speciali chiamati DNA polimerasi, capaci di sintetizzare una nuova molecola di DNA purché siano disponibili nucleotidi in forma di desossiribonucleotiditrifosfato (dNTP) e qualora le eliche del DNA da replicare siano separate.
Non è possibile sintetizzare una molecola ex novo, ma solo prolungare quella esistente in idonee condizioni (temperatura e pH).
La tecnica di laboratorio prevede in prima fase la denaturazione del DNA (fase 1) alla temperatura di 9499 °C, detta temperatura di fusione, cioè la separazione dei due filamenti della doppia catena.
Segue poi la fase di annealing (fase 2), ossia l'appaiamento di tratti complementari della catena aperta con brevi sequenze dette primer, lunghe in genere 2030 basi e possibilmente senza sequenze complementari reciproche per evitare il rischio che si aggreghino tra loro, anziché sulla molecola di DNA da duplicare. È quindi indispensabile per produrre artificialmente i primer e averli a disposizione nei laboratori conoscere almeno in parte la mappa del DNA da testare (attualmente in commercio sono disponibili primer per moltissime specie di organismi). I primer costituiscono l’innesco per la riproduzione del DNA e il processo avviene a una temperatura di 3065 °C. Segue l'estensione (fase 3), che consiste nella replicazione di tratti dei filamenti per mezzo dell’enzima polimerasi in presenza di nucleotidi (come è detto, in natura il processo di amplificazione avviene per merito di speciali enzimi chiamati DNA polimerasi); in laboratorio, attualmente è impiegato l’enzima Taqpolimerasi che ha un picco di efficienza attorno ai 7580 °C e ha un tasso di errore nella replicazione molto basso. In questa fase la temperatura è nuovamente rialzata per ottimizzare l’attività dell’enzima. Il ciclo viene ripetuto parecchie volte, 2030 volte e anche più (exponential amplitìcation) (in teoria, ad ogni ciclo il DNA campione dovrebbe raddoppiare, ma in pratica non è così ed esistono formule matematiche per valutare l’effi cienza dell’amplificazione) finché non si ottiene la quantità di DNA prevista dai protocolli. La quantità iniziale di materiale bersaglio è bassissima, fino all’ordine di 10 ng; anzi, quantità di DNA di partenza relativamente alte possono far diminuire la resa del processo a causa della presenza di contaminanti.

Schematizzazione delle tre fasi di laboratorio che permettono di replicare e aumentare la quantità del genoma studiato.


Esemplificazione dei cicli della terza fase in cui si ha l’amplificazione esponenziale.

La lettura dei risultati è realizzata per mezzo di elettroforesi su gel o capillare; quest’ultima impiega come mezzo separativo una colonna capillare di silice fusa: gli analiti, per azione di un campo elettrico, migrano da una estremità all’altra della colonna e vengono letti in base al loro assorbimento di luce (lettura elaborata da un computer e registrata in forma grafica).


Schema di struttura di laboratorio e di fl usso, per la lettura dei dati dell’esperienza tramite semplice elettroforesi

8 L'ingegneria genetica

L’ingegneria genetica comprende tutte quelle tecniche che consentono di trasferire ad alcune cellule viventi la capacità, ereditaria, di sintetizzare sostanze utili.
Questo processo si svolge con una sequenza di più fasi: identificazione, isolamento, trasferimento del gene.
L’identificazione del gene che produce una ben determinata proteina è forse la parte più complessa del processo.


Schematizzazione delle fasi in cui il gene, identificato e isolato, viene inserito in un’altra cellula che produrrà una nuova proteina.

Innanzitutto bisogna conoscerne la localizzazione nel genoma, per poterlo isolare integro.


Identificazione del gene sulla catena nucleotidica e formazione del DNA duplex.

Negli eucarioti i geni sono molto discontinui e per ovviare a questo inconveniente si ricorre ad un enzima, la trascrittasi inversa, che è in grado di costruire una molecola di DNA partendo dall’mRNA corrispondente al gene desiderato: tale procedura consente di costruire una molecola di DNA duplex o cDNA sulla quale sarà facile lavorare.


Visualizzazione dell’utilizzo della trascrittasi inversa: il gene viene prima identificato, poi si forma il cDNA.
L'isolamento avviene grazie a particolari “forbici" molecolari, gli enzimi di restrizione (endonucleasi).


Visualizzazione del processo di isolamento del gene con gli enzimi di restrizione e successiva saldatura con l’utilizzo della ligasi.

Presenti normalmente nei batteri, che li utilizzano per tagliare il DNA dei batteriofagi e “restringere" così la loro aggressività, gli enzimi di restrizione sono stati scoperti negli anni ’60 del Novecento.
Gli enzimi di restrizione sono endonucleasi che riconoscono e tagliano il DNA a livello di una specifica sequenza nucleotidica di 4-8 bp detta sito di restrizione.
Poiché enzimi diversi riconoscono sequenze nucleotidiche diverse, ogni enzima ha una sua caratteristica specificità.
Nei batteri essi costituiscono un sistema di difesa naturale che distrugge eventuali molecole di DNA estraneo proteggendoli da infezioni virali.
Il nome di ciascun enzima di restrizione deriva dalle prime tre lettere, scritte in corsivo, prese dalla nomenclatura binomiale del batterio di origine, da una lettera maiuscola, che identifica un ceppo particolare di quel batterio, e da un numero romano che indica l’ordine di scoperta, qualora dallo stesso batterio vengano isolati enzimi diversi.
Ad esempio: Eco RI (si legge Eco erre primo) deriva da Escherichia coli Ryl3 (I enzima isolato), Eco RII da Escherichia coli R245 (II enzima isolato).
Esistono due tipi di questi enzimi: alcuni tagliano di netto la molecola di DNA (taglio tronco), altri tagliano la molecola di DNA con una sfasatura di alcuni nucleotidi in specifiche sequenze di 46 nucleotidi, dette palindromi, che possono essere lette in entrambi i sensi senza mutare di significato.
Il luogo in cui avviene il taglio è detto sito di restrizione.
Il taglio può essere tronco o sfasato.
Taglio tronco Taglio sfasato 5'CCGG 5'GAATTC 3'GGCC 3'CTTAA G
I primi non danno possibilità di innesto tra due segmenti di DNA, poiché la loro cesura è netta, mentre i secondi, avendo estremità coesive, rendono possibile l’innesto tra due segmenti di DNA (per questo sono i più utilizzati).
Le estremità tagliate vengono di nuovo saldate assieme (con legame covalente per mezzo di altri enzimi “colla", le ligasi).
Ogni tipo di enzima taglia solo in corrispondenza di una specifica sequenza nucleotidica di riconoscimento. Ne deriva che possono esserci sia pezzi lunghi che corti e che un gene di una cellula eucariotica e un plasmide di un batterio, tagliati entrambi con lo stesso enzima di restrizione, si riconoscano e si uniscano perché hanno estremità coesive complementari.
Le estremità “sporgenti” dei frammenti si associano e vengono saldate mediante legami idrogeno, generando una molecola di DNA chimerica o ricombinante.
Ad esempio l’enzima di restrizione EcoRI, si lega a sequenze specifiche di DNA in doppia elica GAATTC. Taglia in modo sfalsato i legami tra guanina e adenina su entrambi i filamenti (il taglio produce gruppi 3’OH e 5’fosfato), generando frammenti di DNA che hanno quattro basi sporgenti in singolo filamento alle estremità 5’.
Il trasferimento di frammenti di DNA estraneo nelle cellule batteriche avviene a mezzo di un vettore.


Formazione del DNA ricombinante: taglio dei palindromi per lo scambio dei (a) materiali genetici; (b) esemplificazione del taglio e successivo scambio tra DNA batterico e DNA umano per la formazione di DNA ibrido o ricombinante.

Vettori genici

I vettori genici sono sequenze di DNA di diversa natura (virus, plasmidi batterici, cosmidi, cromosomi artificiali) nelle quali è possibile inserire altre sequenze nucleotidiche. Tali strutture sono in grado di integrarsi con il DNAbersaglio e di introdurvi il gene esogeno. La scelta del vettore dipende sia dalla natura della cellula bersaglio (animale, vegetale, procariote) che deve ricombinare il suo DNA, sia dalle dimensioni dell’inserto genico che viene ospitato.



In genere i vettori più usati per i batteri (E. coli) sono i plasmidi e i batteriofagi; per le cellule vegetali è un batterio parassita endocellulare di molte specie di piante, VAgrobacterìum tumefaciens, il cui plasmide Ti è in grado di inserirsi nel genoma della cellula vegetale, mentre per le cellule animali si utilizzano prevalentemente vettori di natura virale.
Un vettore, per svolgere la sua funzione, deve essere costituito da un segmento di DNA detto replicone che lo renda capace di replicarsi nella cellula ospite interagendo con gli enzimi coinvolti nell’avvio della replicazione del DNA, composto da un’origine di replicazione del DNA (ori) e dagli elementi di controllo a essa associati, nonché da uno o più marcatori genetici, come resistenze a antibiotici o marcatori nutrizionali la cui presenza permette di selezionare le cellule ospitanti. Al di fuori di queste regioni essenziali (replicone e marcatore) devono essere presenti singoli siti di taglio per il più alto numero possibile di enzimi di restrizione.

Vettori virali
I vettori virali sono utilizzati soprattutto per introdurre geni esogeni nei batteri e nelle cellule eucariote animali sfruttando la naturale capacità dei virus di integrare il loro DNA con il genoma cellulare che infettano. In natura, infatti, i virus che, essendo costituiti da un involucro di proteine (capside) di ridottissime dimensioni al cui interno è racchiuso il DNA contenente solo le informazioni essenziali, non sono in grado di riprodursi da soli, penetrano all’interno di una cellula e ne utilizzano le strutture di sintesi facendo sì che sia la cellula stessa ad esprimere le informazioni virali e a sintetizzare centinaia di copie del virus. Durante questo processo possono avvenire scambi tra il DNA virale e il DNA cellulare.
In laboratorio è possibile pilotare questo fenomeno di ricombinazione tra i due genomi, per trasferire geni particolarmente interessanti nelle cellule. Alcuni geni del virus vengono sostituiti con geni utili, di qualunque provenienza, e si aggiunge un gene marcatore per verificare l’avvenuto trasferimento. Il virus modificato è ancora in grado di infettare la cellula ma, anziché sfruttarla e distruggerla, la arricchisce delle nuove caratteristiche desiderate. Ogni virus utilizza le proteine del suo capside per riconoscere e infettare un particolare tipo di cellula.
I virus che infettano i batteri sono detti batteriofagi o fagi. Quando un fago infetta un batterio può acquisirne frammenti di DNA che vengono ceduti alla cellula batterica ricevente durante il successivo processo di infezione.


Evidenziazione del ciclo vitale del batteriofago.

Il trasferimento di materiale genetico da un batterio a un altro tramite fagi si chiama trasduzione.
Il DNA virale di un fago, una volta penetrato in una cellula batterica, può integrarsi nel cromosoma batterico e rimanere in fase latente (profago) per molto tempo senza interferire sulla vita della cellula (ciclo lisogenico o lisogeno) oppure può attivarsi e utilizzare le strutture della cellula batterica per riprodursi e distruggere la cellula ospite (ciclo litico).

Plasmidi
I plasmidi sono i primi vettori genici individuati e utilizzati, soprattutto se il DNA da inserire non è di grandi dimensioni. Sono strutture genetiche tipiche dei batteri, costituite da brevi sequenze anulari di DNA batterico extracromosomiche, capaci di duplicarsi per proprio conto e di migrare da un batterio a un altro. In natura, se sottoposti a stress ambientale (carenza alimentare, antibiotici) i batteri effettuano un processo di coniugazione, con il quale una cellula donatrice (F+) trasferisce copia di uno o più plasmidi a una cellula ricevente (F) attraverso un ponte citoplasmatico (pilo sessuale).
Nella cellula donatrice il plasmide inizia a replicarsi a partire da un punto, detto sito di origine della replicazione (ori). Il nuovo filamento penetra attraverso il pilo nella cellula ricevente, la quale duplica a sua volta il filamento ricevuto rigenerando il plasmide completo.


(a) Fasi del processo di coniugazione batterica, (b) schematizzazione della struttura del plasmide.

Questo processo naturale attraverso il quale alcuni procarioti (detti competenti) sono in grado di ricevere del DNA esterno che dà origine a nuove caratteristiche, è sfruttato in laboratorio per far sì che i plasmi di siano vettori ideali per inserire geni esogeni e farli esprimere ai batteri. È in questo modo, ad esempio, che per la prima volta si è riusciti a far sintetizzare a Escherichia colf insulina umana.


La produzione di un plasmide ricombinante consiste innanzitutto nel sottoporre il DNA sorgente (o donatore) a enzimi di restrizione che lo tagliano in frammenti, uno dei quali contiene il DNA bersaglio (inserto) con il gene di interesse. Successivamente gli stessi enzimi vengono usati per creare sul plasmide un punto di rottura complementare in cui poter inserire il DNA esogeno e saldare i frammenti del DNA sorgente al plasmide mediante l’azione della DNAligasi.

Per essere utilizzati come vettori, i plasmi di vengono aperti con lo stesso enzima di restrizione e addizionati per mezzo della ligasi con il frammento di DNA scelto e con geni per la resistenza a vari antibiotici, che permettono di selezionare solo quei batteri che hanno recepito il plasmide.
I batteri trasformati con il plasmide contenente DNA estraneo vengono fatti crescere su terreni contenenti uno o più antibiotici, e così solo quelli che hanno il plasmide possono sopravvivere, mentre gli altri muoiono. I geni per la resistenza agli antibiotici sono detti marcatori di selezione mentre il nuovo DNA è detto DNA ricombinante e i batteri, cellule ricombinanti.


Selezione di batteri ricombinanti operata dall’antibiotico.

Cosmidi
I cosmidi sono vettori artificiali che possono trasportare inserti di DNA di grandi dimensioni (3045 kbp: kbp è l’unità di misura delle sequenze di acidi nucleici; equivale a 1000 paia di basi).
Essi sono un ibrido fra i plasmidi e i virus poiché possiedono il replicone e la resistenza ad antibiotici come i plasmidi, nonché le estremità 5’sporgenti di 12 nucleotidi, dette terminali coesivi (cos) del DNA del fago A, isolato dalle particelle virali.
Il fago A è utilizzato per clonare frammenti di DNA lunghi fino a 25 kbp. Normalmente il genoma del fago è lungo 49 kbp, ma viene ridotto eliminando la porzione centrale con enzimi di restrizione che lasciano estremità coesive. I cosmidi ricombinanti vengono successivamente introdotti nella cellula batterica per trasduzione.


Schematizzazione della struttura del fago l.


Il cosmide, ridotto dalle endonucleasi, diventa ricombinante con l’inserimento di segmenti di DNA lunghi 40 kbp.

Vettori navetta (shuttle)
I vettori navetta sono vettori ingegnerizzati che possono replicarsi stabilmente in 2 diversi organismi: sono perciò compatibili con cellule diverse, ad esempio batteri/lieviti o batteri/animali. Essi consentono, ad esempio, la manipolazione del vettore nelle cellule batteriche (E. coli) e il successivo trasferimento nelle cellule del lievito.


Schema operativo per l’ultilizzo dei vettori navetta.A

Cromosomi artificiali
Oggi sono stati messi a punto cromosomi artificiali con i quali è possibile utilizzare i batteri per clonare grossi pezzi di DNA (200500 kbp). Essi contengono telomeri, centromero e il sito di replicazione autonoma. Sono cromosomi artificiali:
-  YAC, cromosomi di lievito (Yeast Artifìcial Chromosomes):
-  BAC, cromosomi batterici;
-  MAC, cromosomi di mammifero;
-  PAC, cromosomi PI.

Trasferimento

Per facilitare l’ingresso delle macromolecole di DNA nelle cellule, sia batteriche che eucariote, comprese quelle umane, sono state sviluppate diverse tecniche basate su metodi chimici e fisici.
I metodi chimici sono trattamenti con soluzioni fredde di cloruro di calcio, seguito da breve riscaldamento, che rendono le membrane permeabili al DNA.
I metodi fìsici sono l’elettroporazione, il gene gun, la microiniezione.
-  Elettroporazione. Le cellule sono immesse in una soluzione contenente DNA e sottoposte a un breve impulso elettrico di voltaggio elevato (12,515 kV/cm) che produce una transitoria apertura dei pori della membrana, attraverso i quali il DNA entra direttamente nel citoplasma.
-  Gene gun (letteralmente, cannone genico). Usa vere e proprie pistole che sparano ad altissima velocità nei tessuti particelle di oro rivestite del gene che interessa; queste particelle sono in grado di attraversare la membrana citoplasmatica e quella nucleare rilasciando il DNA nel nucleo delle cellule del tessuto bersaglio.
-  Microiniezione. Si usano sottilissimi aghi di vetro, con i quali il DNA estraneo purificato viene iniettato nelle cellule

Clonaggio

La replicazione di un frammento di DNA in molteplici copie uguali, utilizzando un microrganismo ospite, viene definita clonaggio.
Il segmento di DNA di interesse viene inserito in una molecola di DNA in grado di replicarsi autonomamente (un cosiddetto veicolo o “vettore").
Il risultante vettore chimerico (“DNA ricombinante") è introdotto in un organismo ospite, in genere un batterio, che viene fatto riprodurre in modo da generare una popolazione numerosa: tutti i membri della popolazione conterranno molte copie del DNA ricombinante, ottenendo così quantità elevate del DNA inserito inizialmente.
La tecnica consiste nei seguenti passaggi.
1.  Isolamento e preparazione del DNA da clonare: il gene d’interesse viene prima di tutto isolato dall’organismo che lo possiede utilizzando la tecnica della PCR (Polymerase Chain Reaction) la quale permette di ottenere moltissime copie soltanto di questo gene, ignorando le regioni precedenti (a monte) e successive (a valle) ad esso.
2.  Scelta e preparazione del vettore.
3.  Ligazione: specifici frammenti di DNA vengono cuciti tra loro in modo covalente. Nella maggior parte dei casi questo compito è affidato alle ligasi, enzimi che catalizzano la formazione di legami fosfodiesterici tra estremità 3’OH e 5’P di molecole di DNA adiacenti, uguali (ligazione intramolecolare) o diverse (ligazione intermolecolare).
4.  Introduzione dei vettori ricombinanti nell’organismo ospite: se l’ospite è un procariota, come E. coti, o un eucariota unicellulare, come S. cerevisiae, il metodo è detto trasformazione, mentre si parla di trasfezione se l’ospite è un eucariota pluricellulare.
5.  Inserimento dei marcatori di selezione nel vettore: servono a identificare le cellule trasformate (o transfettate). Si tratta di geni in grado di fornire un fenotipo particolarmente visibile o di permettere la sopravvivenza in certe condizioni ambientali, come i marcatori che conferiscono la resistenza a un antibiotico, per il quale l’ospite utilizzato è sensibile. Solo le cellule che contengono il gene di resistenza all’antibiotico saranno in grado di vivere in un terreno contenente quell’antibiotico e di crescere e replicarsi cedendo anche alle cellule figlie il vettore di clonaggio.
6.  Riproduzione del clone trasformato e conseguente amplificazione del numero di copie del DNA di interesse: i nuovi batteri, che contengono DNA di diversa origine, vengono chiamati batteri o cellule ricombinanti. Le cellule ricombinanti vengono prodotte su larga scala con una tecnica definita fermentazione. La proteina così ottenuta (quella codificata dal gene inserito nel plasmide) in grande quantità sarà purificata ed analizzata per determinare l’eventuale presenza di contaminanti.
7.  Analisi del DNA clonato mediante sequenziamento.

Sequenziamento

Il sequenziamento è una tecnica che serve a stabilire, con precisione, l’ordine delle basi in un frammento di DNA. Gli scopi per cui si applica tale tecnica sono molteplici: identificare mutazioni che causano patologie, paragonare i geni tra cellule in cui sono espressi e cellule in cui non sono espressi o sono espressi in parte, ricercare sequenze di regolazione, determinare la sequenza di una proteina corrispondente a una regione codificante, riconoscere i geni di un genoma.
La tecnica del sequenziamento si compone di diverse fasi:
1.  preparazione del DNA stampo, sequenziamento con marcatura che consente di ottenere una serie di frammenti marcati con un’estremità fìssa e una variabile;
2.  separazione usando elettroforesi su gel o elettroforesi capillare ad alta risoluzione;
3.  rilevazione di frammenti di DNA;
4.  lettura della sequenza usando l’autoradiografìa (marcatura radioattiva) o la reazione con i fluorocromi (marcatura a fluorescenza).
I metodi che si possono utilizzare per sequenziare il DNA sono descritti di seguito.
1.  Metodo chimico di Maxam e Gilbert attraverso cui il DNA è tagliato chimicamente in corrispondenza di basi specifiche e i prodotti di taglio sono analizzati su gel elettroforesi. Si preparano 4 miscele di reazione diverse (una per ogni base); in ogni miscela si producono frammenti di lunghezza diversa che vengono separati su gel di poliacrilammide. Il passaggio successivo è l’autoradiografìa del gel.
2.  Metodo enzimatico di Sanger, detto anche dei terminatori di sintesi enzimatica o dei dideossi, in cui il Dna da sequenziare è replicato a partire da un primer radiomarcato. Il filamento neosintetizzato si spezza per la presenza di dideosiinucleotidi che, mancando il gruppo OH al 3’, non consentono il formarsi del legame fosfodiesterico con il nucleotide successivo e analizzato con l’autoradiografìa.
3.  Sequenziamento automatico del DNA in fluorescenza. È un sistema di lettura automatico che prevede l’utilizzo di nucleotidi trattati (fluoro cromi).
I prodotti di sintesi vengono fatti correre sulla stessa corsia di un gel denaturante, un laser eccita i fluorocromi, ciascuno dei quali emette una luce d’onda caratteristica e tramite un sistema automatizzato viene riportata su un personal computer la corretta sequenza nucleotidica del frammento analizzato.

BIOLOGIA APPLICATA E BIOTECNOLOGIE AGRARIE
BIOLOGIA APPLICATA E BIOTECNOLOGIE AGRARIE
GENETICA, TRASFORMAZIONI, AGROAMBIENTE