BIOLOGIA APPLICATA E BIOTECNOLOGIE AGRARIE

4 Le colture cellulari animali

Le colture di cellule animali vengono utilizzate sia nell’ambito della biologia cellulare sia in biologia molecolare. Nel primo caso sono usate per studi di tipo funzionale, sulla regolazione delle proteine e dei geni, sui meccanismi di crescita (metabolismo e differenziamento cellulare, ecc.). Nel secondo caso possono essere usate per l’estrazione di acidi nucleici (RNA e DNA), per la purificazione di proteine, per studi di espressione genica e analisi dell’effetto delle mutazioni geniche. La loro creazione trova numerose applicazioni pratiche: in medicina per la produzione di cellule staminali e di tessuti in vitro (come il tessuto epidermico artificiale, il tessuto endoteliale che riveste internamente i vasi sanguigni); in oncologia per caratterizzare dal punto di vista biochimico e molecolare diversi tipi di tumori; in genetica cellulare per le diagnosi prenatali; in farmacologia per test di tossicità di droghe o farmaci e sostanze inquinanti, e per la produzione di proteine ricombinanti e di anticorpi monolocali.
L’allestimento delle colture prevede:
1.  frammentazione del tessuto e dissociazione delle cellule mediante breve digestione con tripsina;
2.  semina delle cellule in uno specifico terreno di coltura e loro crescita in condizioni fìsiche controllate;
3.  distacco delle cellule e allestimento di nuove colture (subcolture). Le cellule devono essere coltivate in condizioni assolutamente sterili.
Le cellule in coltura si dividono in primarie, immortalizzate o trasformate. Le cellule primarie sono quelle che derivano dal tessuto o dall’organo e di solito hanno un tempo di sopravvivenza in coltura piuttosto limitato. Le subcolture sono linee che derivano da cellule primarie, non sono immortali e di solito dopo un certo numero di duplicazioni, variabile a seconda del tessuto e della specie oggetto di studio, cominciano a degenerare per poi morire.


Osservando le colture di cellule endoteliali, riprodotte in laboratorio, si nota come esse si depositano a caso sulla superficie del substrato per poi organizzarsi spontaneamente nel formare una rete di vasi capillari, del tutto simile alle reti dei capillari presenti nei tessuti in vivo. Le cellule si ripiegano sino a formare il lume del capillare rispondendo pienamente ai comandi presenti nel loro codice genetico.

Sia le colture di cellule immortali che quelle trasformate hanno invece una capacità moltiplicativa illimitata. In base alla loro forma, le cellule delle colture in vitro si distinguono in cellule fusiformi, come i fìbroblasti, e cellule poligonali, di tipo epiteliale. I fìbroblasti rappresentano le colture cellulari più usate poiché si adattano meglio alle condizioni di crescita in vitro; comunque sono assai diffuse anche le colture di cellule endoteliali, cellule nervose e cellule emopoietiche.
Una ulteriore classificazione delle cellule utilizzate in vitro suddivide le cellule in: aderenti (o cellule in monostrato) e non aderenti (cellule in sospensione). Le cellule aderenti si attaccano sul fondo di una fiasca o di una piastra di plastica e crescendo per mitosi formano monostrati cellulari che devono essere staccati. Le cellule in sospensione, invece, normalmente non si attaccano alla superfìcie del contenitore. Le caratteristiche di aderenza o non aderenza delle colture cellulari in vitro dipendono di solito dalla posizione di origine nell’organismoanimale vivo. Ad esempio: quasi tutte le cellule in sospensione derivano dalle cellule che in vivo circolano (in sospensione) nel sangue, come i linfociti T e B del sistema immunitario, oppure da cellule loro precursori. Le cellule aderenti derivano invece da tessuti (muscoli, fegato, sistema nervoso, rene) e all’interno dell’organismo non si muovono.




Cellule fusiformi (a) e poligonali (b) osservate in tessuti animali affetti da patologie.

Le colture cellulari presentano numerosi vantaggi poiché rappresentano sistemi molto semplici, riproducibili, abbastanza economici e rapidi nel tipo di risposta che possono dare. Presentano anche diversi svantaggi poiché le cellule in coltura sono soggette a una elevata instabilità genetica e possono subire mutazioni che fanno perdere alcuni dei caratteri fìssati dopo un certo numero di passaggi successivi.

Le cellule staminali

Attualmente, in quasi tutti i campi della scienza applicata alla medicina, sono di grandissimo interesse le cellule staminali, particolari cellule non specializzate (o non differenziate), in grado di riprodursi attraverso il processo di divisione mitotica e di generare tutti i tessuti del corpo attraverso un processo detto “differenziazione.
Esse infatti, per la loro abilità di potersi differenziare in cellule specializzate per una particolare funzione, possono sviluppare tessuti per la cura di patologie anche gravi. Esistono due tipologie di tali cellule: cellule staminali embrionali e cellule staminali adulte. Le prime, presenti nell’embrione umano, derivano dalla fusione di ovulo e spermatozoo al momento del concepimento e hanno il compito di produrre le cellule specializzate nel nuovo individuo; le seconde, invece, presenti nei tessuti degli adulti (soprattutto nel midollo osseo), svolgono il ruolo di organo riparatore per le cellule specializzate e di mantenimento del riciclo di sangue.


Specializzazioni ottenibili da una singola cellula staminale ancora indifferenziata.

In base alla loro potenzialità queste cellule si distinguono in: staminali unipotenti, che possono riprodurre solo cellule del tessuto al quale appartengono; staminali multipotenti, che possono evolvere una cerchia ristretta di cellule; staminali pluripotenti, che sono presenti nel feto e nel cordone ombelicale e possono differenziarsi in quasi tutti i tipi di cellule specializzate; staminali totipotenti, presenti nell’embrione.
Queste ultime sono in grado di evolvere entro il 14° giorno differenziandosi sino a creare un completo essere vivente.
Potenzialmente queste cellule possono rappresentare una fonte illimitata per creare ossa, muscoli, fegato o globuli rossi, ma non tutti ritengono lecito ed etico danneggiare un embrione umano o utilizzare degli embrioni già formati allo scopo di ricerca.


Schema di ottenimento e differenziazione di cellule staminali di origine embrionale e successive fasi di derivazione nei diversi tessuti possibili.

Nell’adulto, l’utilizzo di cellule staminali, capaci di dare origine solo a cellule proprie di un dato tessuto, trova numerose applicazioni e, poiché i nuovi tessuti derivano da cellule geneticamente identiche, si possono risolvere anche problemi di rigetto in caso di trapianto.
Negli ultimi tempi sono state ottenute cellule staminali indotte pluripotenti iPS o iPSCs (Induced Pluripotent Stem Cells). Il nuovo sistema è eticamente compatibile con la ricerca perché queste staminali sono ottenute riprogrammando cellule già adulte e non attraverso lo sviluppo di embrioni.


Possibili applicazioni di cellule staminali prelevate da midollo osseo; dopo la loro messa in coltura si differenziano: si possono così ottenere tessuto osseo, connettivo e muscolare striato. La tecnica di prelievo, differenziazione e trapianto di cellule staminali prevede:
1) prelievo delle cellule dal corpo del paziente; 2) coltivazione delle cellule in laboratorio e loro moltiplicazione per mitosi per aumentarne la quantità; 3) trattamento delle cellule per indurle alla differenziazione in cellule specializzate, a seconda del tessuto richiesto; 4) le cellule differenziate, tissutali, sono innestate nell’organo del paziente che necessita di essere riparato e rigenerato.

5 Gli ibridomi

Nel 1960, in Francia, si osservò per la prima volta che nella coltura comune di due linee di cellule tumorali di topo si formava un nuovo tipo di cellule, con caratteristiche morfologiche e modalità di sviluppo diverse da entrambe le linee. Due cellule con caratteristiche proprie si fondevano, cioè, per formare una cellula nuova.
La frequenza della fusione era piuttosto bassa, ma si riuscì ad accrescerla con l’uso del virus emoagglutinante del Giappone completamente inattivato per eliminare qualsiasi complicanza di infezione.
Si erano ottenuti gli ibridomi, ovvero cellule miste con caratteristiche diverse da quelle delle linee parentali, ma comunque derivate da esse.


Schematizzazione dell’ottenimento di ibridomi:
1.  le cellule vengono stimolate a fondersi con il virus emoagglutinante del Giappone o con agenti diversi, come il glicol pohetilenico (PEG);
2.  prima si fondono le membrane e se ne forma una sola: al microscopio appare una grande cellula con più nuclei distinti;
3.  dopo alcune ore anche i nuclei si fondono e se ne forma uno solo contenente il materiale genetico dehe cellule originarie;
4.  le nuove cellule ibride vengono isolate.

La linea cellulare ibrida viene propagata in coltura in vitro.
Se nella fusione iniziale intervengono più cellule, derivate da più organismi, la nuova cellula ibrida ha poche probabilità di sopravvivenza, ma se le cellule iniziali derivano da due soli organismi diversi, la “nuova cellula sopravvive e comincia a moltiplicarsi.
La relativa facilità della tecnica ha suscitato immediatamente grande interesse nel mondo scientifico e numerosi sono stati gli esperimenti.
Dapprima si usarono solo cellule animali dal momento che le cellule vegetali, protette da una rigida parete di cellulosa, ponevano più problemi se sottoposte a questo tipo di manipolazioni.
Si è giunti a fondere cellule somatiche di vertebrati di ordine diverso: uomo/topo, scimmia/topo, topo/pollo. Nel corso delle divisioni la cellula ibrida, però, perdeva progressivamente alcune caratteristiche e così nel primo caso erano i cromosomi umani a essere eliminati, nel secondo quelli della scimmia e così via. Ciò dimostra che l’ibrido costruito con cellule molto diverse fra loro è instabile. Un ibridoma uomo/topo, inoltre, non potrà originare un uomotopo perché le cellule animali, anche in coltura, dopo un certo numero di mitosi muoiono, a meno che non si tratti di cellule tumorali le cui proprietà di crescita sono del tutto diverse da quelle normali.
Le ricerche sono continuate e l’impiego dei protoplasti, ottenuti per eliminazione enzimatica della parete cellulare, ha permesso di estendere la tecnica consentendo di ottenere ibridi tra cellule animali e cellule vegetali.
Per i vegetali le cose dovrebbero essere diverse, dal momento che da una cellula in coltura è possibile rigenerare un’intera pianta; almeno secondo regole teoriche, bisognerebbe poter produrre piante con le caratteristiche di entrambi i genitori.
In realtà anche in questo caso si è riscontrata incompatibilità fra due patrimoni genetici troppo dissimili e i risultati non sono stati molto più brillanti di quanto si ottiene incrociando per via sessuale le piante di partenza. Un ibrido risulta tanto più stabile quanto più simili tra loro sono le cellule da cui deriva. La tecnica consiste in:
1.  isolamento delle cellule ed eliminazione della parete per ottenere i protoplasti;
2.  fusione dei protolasti che formano gli ibridomi;
3.  moltiplicazione e sviluppo degli ibridomi fino a evolversi in piante che potranno fiorire e riprodursi.
Tale modalità di riproduzione ha ottenuto un buon successo fondendo due specie di Nicotiana (N. glauca + N. langsdorffi) e, poiché le cellule sono somatiche, il numero cromosomico risulta doppio, ottenendo una specie ibrida poliploide in grado di riprodursi. Più diffìcile è l'ottenimento di ibridomi fra specie differenti, per cui sono scarsi, per ora, i risultati raggiunti.


Esemplificazione della combinazione cromosomica sperimentale uomo/topo


Non senza difficoltà e comunque con caratteristiche inferiori rispetto alle cellule di partenza, si è riusciti ad ottenere dall’unione di due solanacee, patata e pomodoro, il pomato, un ibrido con caratteristiche della patata nella parte ipogea e del pomodoro in quella epigea. Un esperimento è stato tentato fra specie appartenenti ai generi Petunia e Nicotiana, mentre in Giappone sono stati uniti mandarino e arancio, piante del genere Citrus assai affini fra loro.
Nei vegetali la fusione dei protoplasti si presenta come la via per introdurre caratteristiche nuove nella pianta; infatti l’ibridoma non perde completamente l’informazione genetica di una delle due cellule e dà origine a una cellula che nel proprio patrimonio genetico ha incorporato nuove informazioni.


Ibridazione somatica fra due specie di Nicotiana (N. langsdorffi e N. glauca). Dalla foglia si isolano delle cellule (rappresentate come quadratini) che, private della membrana, diventano protoplasti sferoidali (1). Mescolati i protoplasti delle due specie in una provetta, avvengono alcune fusioni a coppie (2). I prodotti della fusione (cerchietti con due punti) fra protoplasti delle due specie possono evolversi in piante, che potranno fi orire e riprodursi (3).

Da questa cellula, detta ibrido asimmetrico, si origina una pianta che ha tutte le caratteristiche di una delle due piante originali, più alcuni tratti dell’altra. In particolare, e soprattutto in funzione del miglioramento genetico, gli ibridomi possono consentire di introdurre geni di resistenza tipici delle specie selvatiche in specie domesticate.
È il caso della patata domestica (Solanum tuberosum) che viene ibridata con la specie selvatica (.Solanum brevides). Incompatibili per una riproduzione sessuata, le due specie sono sufficientemente simili per la fusione.

Gli anticorpi monoclonali

Lo studio degli ibridomi ha consentito di ottenere gli anticorpi monoclonali molto utili in medicina.
Quando virus, batteri o protozoi, capaci di creare malattie infettive entrano in un organismo, vengono da questo riconosciuti come “estranei" da due tipi di cellule: i linfociti T, forniti di specifici recettori di membrana, e i linfociti B, capaci, invece, di agire indirettamente producendo anticorpi.
Chimicamente gli anticorpi sono proteine (immunoglobuline) formate da una parte costante, tipica per ogni gruppo e da una parte variabile, specifica per ogni antigene esistente.
I microrganismi responsabili delle malattie infettive sono dotati di tanti antigeni con caratteristiche diverse e, quando il microrganismo infetta l’uomo, questi sviluppa nel siero tanti anticorpi quanti sono gli antigeni, sviluppa cioè una risposta policlonale.
Nel 1975, furono Kohler e Milstein che misero a punto una tecnica per produrre una cellula immortale, capace di secernere un solo anticorpo di specificità definita: l’anticorpo monoclonale.


La scoperta, come già era accaduto a Watson e Crick nel 1962, valse loro il Premio Nobel per la Medicina nel 1984. Gli anticorpi monoclonali possono essere utilizzati per eseguire test ormonali, per fare la diagnosi di malattie virali o la diagnosi precoce di tumori. L’uso di un anticorpo monoclonale marcato con iodio radioattivo, iniettato in malati già con diagnosi clinica di tumore al colon e al retto, ha consentito di determinare con estrema precisione l’estensione del tumore originario e le sue ramificazioni nell’organismo (metastasi). La tecnica della produzione di anticorpi è distinta in tre fasi: immunizzazione, coltura selettiva, produzione di anticorpi e viene schematizzata qui di seguito. Dopo il 1979 sono stati preparati in molti laboratori americani anticorpi monoclonali che reagivano con gli antigeni del cancro del polmone, del seno, del colon, del pancreas, del melanoma, dei linfomi e delle leucemie; tutti strumenti utili, quindi, nella diagnosi precoce e anche in terapia, dove potrebbe esistere un uso in sieroterapia o per vaccini a elevata specificità o per neutralizzare l’azione dei linfociti responsabili del rigetto nei trapianti.


Le tre fasi per la produzione di anticorpi.


6 La clonazione animale

Il termine clonazione (riproduzione di individui uguali), riferito ad organismi pluricellulari, può avere due significati.
Il primo significato fa riferimento al trapianto del nucleo di una cellula adulta, quindi già differenziata, in una cellula uovo il cui nucleo è stato rimosso. L’uovo ibrido così ottenuto può riprodurre individui tutti uguali con le caratteristiche del nucleo della cellula adulta donatrice.


È il caso di Dolly, la pecora più famosa del mondo. L’eccezionalità di Dolly non sta nel fatto che fosse geneticamente uguale a un’altra pecora (anche i gemelli monovulari lo sono, ma essi derivano da un’unica cellula che si è divisa, quindi condividono nucleo e citoplasma), ma nel fatto che è stato utilizzato come nucleo donatore il nucleo di una cellula specializzata come quello della mammella, nucleo che è riuscito a riprogrammarsi e, lavorando in sincronia con il nuovo citoplasma, ad iniziare lo sviluppo embrionale.
Impiantato nell’utero di una pecora ospite che gli ha trasmesso calore e nutrimento, l’embrione è cresciuto ed è nata Dolly.
L’eccezionaiità del fatto ha sollevato molte perplessità e da alcuni scienziati è stato posto il dubbio del falso scientifico: come spesso accade nelle cellule adulte (la pecora donatrice aveva sei anni) con la senescenza si verificano mutazioni e si perde la capacità di mantenere intatte tutte le informazioni e i meccanismi per svolgere le normali funzioni cellulari.
Il secondo significato fa riferimento ai blastomeri, le cellule che formano l’embrione nei suoi stadi iniziali.


(a) Utilizzo di cellule staminali in coltura. (b) Tecnica di produzione di embrioni congelati.

Ogni blastomero possiede un genoma completo e ha la capacità di sviluppare un nuovo individuo, solo, però, se protetto da un involucro nutritivo (zona pellucida).
Quando si scoprì che la funzione di involucro nutritivo poteva essere svolta da una membrana ricavata da alghe marine, si separarono i blastomeri di embrioni e si ottennero cloni.
Alcuni di essi riuscirono a raggiungere lo stadio in cui potevano essere trasferiti in utero.
Si ottennero in questo modo numerosi embrioni (di riserva).
Queste metodiche, utilizzate in campo animale, possono essere estese anche all’uomo e perciò i problemi sono molto grandi, soprattutto dal punto di vista etico.

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GENETICA, TRASFORMAZIONI, AGROAMBIENTE