Capitolo 3 Biotecnologie innovative

3 Biolotecnologie
innovative




Traccia dei contenuti
1 Introduzione
2 Le biotecnologie cellulari
3 Le colture cellulari vegetali
- Tecnica delle colture vegetali in vitro
- Classificazione delle colture in vitro
4 Le colture cellulari animali
- Le cellule staminali
5 Gli ibridomi
- Gli anticorpi monoclonali
6 La clonazione animale
7 Le biotecnologie molecolari
- La reazione a catena della polimerasi
8 L’ingegneria genetica
- Vettori genici
- Trasferimento
- Clonaggio
- Sequenziamento
9 DNA e RNA antisenso
10 Librerie geniche o genoteche
11 Ibridazione di acidi nucleici
12 La terapia genica
Sintesi
Le moderne biotecnologie si basano sempre più su studi e ricerche di biologia cellulare e molecolare. Le applicazioni biotecnologiche sin dentro la cellula consentono di sviluppare anche interi organismi partendo da una o poche cellule base; consentono inoltre di produrre, attraverso la fusione, nuove cellule con caratteristiche miste rispetto a quelle parentali e di clonare organismi pluricellulari ottenendone altri perfettamente identici. Le applicazioni biotecnologiche alle biomolecole consistono nell 'individuare materiale genetico con caratteristiche utili, trasferirlo in cellule di altri organismi anche molto diversi per conferirgli caratteristiche utili; oppure si interviene direttamente per modificare i geni che contengono le istruzioni che interessano per produrre specifiche proteine funzionali o strutturali alle ricerche.
Abstract
Chapter 3 Innovative biotechnoiogies
Modem biotechnoiogies are increasingly based on studies and research of cellutar and molecular biology. Biotechnological applications, even within thè celi itself, enable to develop whole organisms starting from one or few basic cells; to produce, through fusion, new cells with mixed features compared with the parent ones; to clone multi cellular organisms in order to obtain perfectly identica! ones. Biotechnology applications to biomolecules consist in identifying genetic matter with useful characteristics, transferring it into cells of other, even very different organisms, in order to provide them with these useful characteristics. Otherwise the applications consist in directly intervening to modify the genes which contain interesting instructions to produce specific proteins, functional or structural to our research.

1 Introduzione

Le biotecnologie innovative a differenza delle biotecnologie tradizionali che, derivando dalle secolari conoscenze naturalistiche e mediche dell’umanità, hanno trovato applicazione nel progressivo sviluppo della scienza e della tecnica per gli impieghi destinati principalmente all’alimentazione e alla cura della salute, e riguardano la scoperta, l’ideazione e la realizzazione di procedure, strumenti e soggetti che in precedenza non esistevano. Queste nuove tecniche permettono di manipolare in modo accurato e altamente selettivo organismi viventi partendo dalla comprensione del loro genoma, e sono capaci di modificarne l’informazione genetica e di manipolare in laboratorio altri materiali biologici (cellule, acidi organici, enzimi) per mettere a punto nuovi prodotti biotecnologici.
Per questo le biotecnologie sono senza dubbio una delle tecnologie d’avanguardia più promettenti per il nostro futuro: nel settore sanitario ci permetteranno di produrre nuovi medicinali e di mettere a punto nuove tecniche, in modo più sicuro ed economico. In questo senso la ricerca sulle cellule staminali apre la via alla sostituzione di tessuti e di organi per trattare malattie degenerative come l’Alzheimer, il morbo di Parkinson e svariate altre.
Nel settore agroalimentare le biotecnologie ci consentiranno di migliorare la qualità delle produzioni e degli alimenti, per l’uomo e per gli animali, contribuendo alla prevenzione delle malattie e alla riduzione dei rischi per la salute.
Nei settori non alimentari, le biotecnologie concorreranno sia a migliorare l’uso delle materie prime industriali (ad esempio nei settori energetico e farmaceutico) sia ad applicare nuove procedure nel settore delle trasformazioni (nuovi prodotti). Inoltre, dal punto di vista ambientale ci permetteranno sia una miglior protezione dell’ambiente (aria, acqua, suolo), sia la possibilità di abbattere fortemente le criticità della gestione dei rifiuti e degli scarichi biologici urbani.
Naturalmente, al pari di molte grandi scoperte che hanno storicamente presentato all’uomo anche l’altra faccia (negativa) della medaglia, anche le biotecnologie suscitano un grande dibattito e sollevano rilevanti questioni etiche, sia negli ambienti della ricerca, sia nei settori deputati alle loro applicazioni, ma soprattutto nell’opinione pubblica delle democrazie più avanzate.
Si pensi alla determinazione dei rischi/benefici che investe in prima persona l’uomo, ma che si estende anche a tutti gli altri organismi viventi del pianeta per i quali l’uomo può decidere, nel bene e nel male.






L’Organizzazione mondiale per la cooperazione e lo sviluppo economico (OCSE) è convinta che le biotecnologie (bioeconomia) possiedano tutti i requisiti per garantire, nel lungo periodo, la sostenibilità economica e ambientale del nostro pianeta. A questo tema ha dedicato un nuovo studio tramite l’International Future programme, che punta a definirne una “policy agenda” sino al 2030.

2 Le biotecnologie cellulari

La possibilità di intervenire sulle cellule è ormai entrata, da anni, nel lavoro quotidiano di quasi tutti i laboratori di ricerca con la produzione di colture cellulari dette anche colture in vitro.
Esse, partendo da cellule, tessuti o organi espiantati dall’organismo, costituiscono una fonte pressoché inesauribile di materiale di studio abbondante e omogeneo poiché continuano a svolgere le loro funzioni per un periodo di tempo, che può essere in taluni casi anche illimitato. Le colture cellulari, sviluppate in laboratorio attraverso condizioni di rigorosa sterilità, si impiantano (a partire anche da minuscoli frammenti) su un terreno di coltura adatto al tipo di cellule, che per questo differisce a seconda che si operi con cellule vegetali o animali: pesci, anfìbi, rettili, uccelli o mammiferi.
I terreni di coltura in genere sono sintetici, costituiti da sostanze fondamentali (amminoacidi, zuccheri, vitamine, sali inorganici, ecc.), sciolti in soluzione a pH e a pressione osmotica controllati. I vantaggi di tali colture derivano dal fatto che rappresentano sistemi molto semplici e facilmente riproducibili, e oltretutto consentono di analizzare i meccanismi cellulari in un ambiente altamente controllabile dall’operatore
Sono sistemi abbastanza economici e rapidi nel tipo di risposta che ci possono dare e hanno disponibilità molto elevata e costi contenuti; inoltre, nel caso di colture cellulari animali, possono almeno in parte evitare il sacrificio di animali da esperimento.


(a) Isolamento virale in tessuto animale ottenuto tramite inoculazione di colture cellulari recettive e luminescenti. (b) Le colture cellulari di Passiflora incarnata, pianta officinale contenente sostanze antiossidanti e precedentemente sottoposta a diversi trattamenti mutageni, hanno permesso di capire che la produzione di flavonoidi era considerevolmente aumentata nei soggetti trattati con raggi ultravioletti del tipo UVB: questo tipo di radiazioni ha forte potere mutageno a carico del DNA nucleare.

3 Le colture cellulari vegetali

Le prime piante a essere moltiplicate in vitro sono state specie ad alto valore commerciale come le piante ornamentali, soprattutto orchidee, ma oggi sono tante le piante di interesse agrario, come fragole, ortive, alberi da frutto ed essenze forestali di diffìcile moltiplicazione che vengono propagate con tale metodica.
La tecnica è relativamente semplice e consente di lavorare su materiale miniaturizzato in una situazione generale ottima per quello che riguarda le condizioni ambientali, i fattori nutrizionali, gli ormoni, l’assenza di parassiti vegetali e animali.
Molteplici, infatti, sono i vantaggi delle colture in vitro che ci consentono di:
- produrre piante omogenee, geneticamente identiche alla pianta madre. Dato che non derivano da riproduzione sessuale non vi è rimescolamento dei caratteri;
- produrre un elevato numero di piante in qualsiasi stagione: il numero di piante complete che si possono sviluppare da un piccolo frammento nel giro di pochi mesi è elevatissimo e ciò comporta risparmio di tempo rispetto alle tecniche di propagazione tradizionale. Le piante, svincolate dai cicli naturali, possono essere moltiplicate in ogni periodo dell’anno;
- eseguire manipolazioni genetiche, in quanto questa tecnica apre la strada alle manipolazioni genetiche delle piante superiori e consente di ottenere un modello di sviluppo diverso della pianta allevata normalmente;
- approfondire le conoscenze scientifiche poiché la disponibilità di colture di cellule o di organi isolati ha permesso di osservare più facilmente le proprietà del ciclo cellulare nonché la fisiologia, la biochimica e la genetica delle piante. È grazie al comportamento delle cellule in coltura che si è evidenziato il ruolo degli ormoni vegetali nella formazione degli organi (auxine per la produzione di radici, citochinine per quella dei germogli, ecc.);
- migliorare la ricerca fitopatologica in quanto è possibile indagare sulla penetrazione e replicazione dei virus, sulla coltivazione di parassiti obbligati, sulle interazioni ospiteparassita, nonché effettuare test per frtotossine e studi sulle nodulazioni, ecc.


(a) Colture in vitro in capsule Petri nelle prime fasi di riproduzione dei materiali espiantati;
(b) tessuti espiantati e posizionati in provettone con substrato contenente sostanze nutritive (minerali e organiche) e ormonali (fìtoregolatori) per stimolare la riproduzione cellulare.

Tecnica delle colture vegetali in vitro

La rigenerazione delle piante “in vitro" avviene in tre momenti distinti.
I primi due si svolgono in condizioni particolari di asepsi (sterilità) dell’ambiente di incubazione e del mezzo nutritivo.
Fase di prelievo - Il prelievo delle parti di pianta deve avvenire in condizioni di assoluta sterilità per evitare che eventuali microrganismi dell’ambiente, la cui velocità di crescita è molto superiore a quella delle piante, entrino in competizione per il nutrimento con la pianta da coltivare.
Le operazioni di prelievo devono essere eseguite in ambiente sterile e perciò ci si avvale di strumenti quali: cappa a flusso laminare sterile, autoclave a pressione, sterilizzatore per pinze e bisturi. Nel vaso di coltivazione deve essere presente un solo tipo di organismo vegetale, cioè quello che si vuole coltivare.
Fase di moltiplicazione - La coltura vera e propria ha inizio quando il prelievo viene inserito sul mezzo nutritivo entro contenitori in vetro di vari tipi: vasetti da 500 cc tondi o allungati, scatole petri, provette.
La composizione del mezzo nutritivo è diversa da coltura a coltura e può essere in forma liquida o gelatina. I costituenti minimi sono i sali inorganici, uno zucchero (di solito il saccarosio), una o più vitamine, acqua deionizzata o distillata, amminoacidi e additivi ormonali (in particolare auxine e citochinine). Per solidificare i mezzi nutritivi il prodotto più usato è l’agaragar.


(a) Sviluppo in vitro di embrioni immaturi derivati da incroci frutticoli di pesco. La tecnica permette di sviluppare piante da ogni embrione, piante che difficilmente avrebbero potuto germinare autonomamente,
(b) Sviluppo in vitro di piantina di carciofo da avviare a successiva moltiplicazione per realizzare il materiale (piantine sane standard) per rimpianto della carciofaia.

La coltura di tessuti vegetali avviene in sale di coltura o di vegetazione con luce e temperatura controllate.
Il fotoperiodo, l’intensità e il tipo di luce giocano ruoli fondamentali nello sviluppo delle piante, mentre la temperatura influisce sulla velocità di crescita. Normalmente il fotoperiodo è di 18 ore di luce e 6 ore di buio, l’intensità luminosa media è di 2500 lux, la temperatura ottimale è di 2224 °C.
Fase di ambientamento - Terminata la fase nel laboratorio, le piantine radicate in vitro lasciano l’ambiente asettico per essere poste in serra; esse, infatti, non possono ancora essere piantate direttamente in campo, dove morirebbero in breve tempo perché ancora troppo delicate.
Per la fase intermedia, di ambientamento in serra, le piantine vengono trapiantate in vasetto o in contenitori alveolati su un substrato di torba e di agriperlite. È un periodo di 2540 giorni in cui le piantine “imparano a vivere in un ambiente normale per poi essere pronte a essere piantate in campo.


Formazione di calli (c, d) da un espianto di fusto di tabacco (a, b).

Classificazione delle colture in vitro

Le colture in vitro possono essere classificate in base al tipo di organizzazione cellulare o in
base al tipo di materiale vegetale utilizzato.
Secondo il tipo di organizzazione cellulare distinguiamo le seguenti tipologie.
1. Colture organizzate sono simili alla propagazione vegetativa in vivo, con tagli, divisioni, sviluppo di gemme ascellari e germogli.
Se la coltura è tecnicamente ben eseguita, le piante ottenute sono perfettamente identiche alla pianta di partenza.
2. Colture non organizzate cellule o tessuti isolati da parti organizzate già differenziate della pianta, vengono stimolati a “sdifferenziarsi’’ e a moltiplicarsi in forma indifferenziata, di solito sotto forma di tessuto calloso, su terreni di coltura con alte dosi di auxine e di citochinine.
La stabilità genetica è spesso molto bassa.


(a) Piantine di vite micropropagate (15 giorni dopo l’espianto), (b)Piantine di vite pronte per passare alla fase di ambientamento, (c) L’accelerazione dei cicli biologici e il primo ambientamento delle piante micropropagate avvengono in serra.


3. - Coltura organizzata o nonorganizzata ha caratteristiche intermedie fra le prime due. Da organi o tessuti si creano con opportune tecniche, tessuti callosi indifferenziati che, coltivati e stimolati, danno origine nuovamente a organi (radici, germogli) o a piante complete (proembrioni o embrioni).

La progenie può presentarsi diversa dalla pianta madre originaria.
Secondo il tipo di “materiale vegetale abbiamo: protoplasti, piante intatte, semi, organi, espianti, tessuti, cellule che esamineremo di seguito in maniera dettagliata.



Coltura di protoplasti
È una tecnica conosciuta fin dal 1930 e consente di far crescere in vitro singole cellule derivate da vari organi della pianta, sfruttando la caratteristica tipica dei vegetali di poter passare da cellule differenziate a cellule indifferenziate. Essere riusciti ad isolare protoplasti vitali capaci di rigenerare piante complete ha aperto nuove strade alla ricerca scientifica e tecnologica. La produzione e l’utilizzo di protoplasti avviene con le seguenti fasi.
1.  Il tessuto vegetale, sterilizzato, viene sottoposto all’azione di enzimi cellulasi per rimuovere le pareti di cellulosa delle cellule vegetali.
2.  Si separano i protoplasti che, privi della parete rigida, assumono forma sferica.
3.  Dopo alcune ore i protoplasti cominciano la ricostruzione della parete, terminata la quale si dividono per mitosi.
4.  Da ogni singolo protoplasto si ottiene un aggregato di cellule detto callo . Il callo è formato da cellule indifferenziate che hanno perso la forma e la funzione originali e possono moltiplicarsi indefinitamente. Dal callo, opportunamente trattato con dosaggi di ormoni e di nutrienti aggiunti al terreno di coltura, si ottiene una pianta simile a quella di partenza.
5.  Il processo di rigenerazione in un callo può dare origine a un embrione (embriogenesi somatica), come succede per le colture in vitro di carota, o ad organi (organogenesi somatica), come nel tabacco in cui, a seconda dei dosaggi ormonali, si ha lo sviluppo di radici o di germogli.
La pianta ottenuta è sempre un clone della pianta madre e il processo prende il nome di clonazione.


(1) Da una pianta che si vuole clonare si toglie una foglia (2) e si prende una porzione di tessuto (3). Si rimuovono in vitro le pareti (45) ottenendo i protoplasti (6) che vengono fatti moltiplicare (7). Le cellule che sopravvivono si riproducono (89) e con l’aggiunta di ormoni si formano radici e germogli (10). La pianta subisce ora un periodo di ambientamento (11).


Coltura in vitro da protoplasti con sviluppo di callo ancora indifferenziato.

Coltura di piante intatte (semi di orchidee)
La coltura di piante intatte è simile, nei princìpi, a quella naturale e può avvenire sia per seme sia per propagazione.
Viene effettuata per quelle specie che in ambiente naturale trovano difficoltà a riprodursi, come le orchidee, il cui sviluppo dipende dall’attività di una micorriza. In vitro la funzione della micorriza è sostituita da un’opportuna nutrizione costituita da un substrato a cui si aggiunge tiamina, inositolo, latte di cocco e frullato di banane.
Su di esso si fa cadere la peluria, interna al baccello, contenente i semi. Il ciclo di allevamento viene accorciato tanto che nel giro di due o tre mesi si ottiene un numero elevatissimo di piantine.


Fasi successive della propagazione dei semi delle orchidee. La tecnica permette di ottenere un elevato numero di piante da semi con bassa energia germinativa.

Coltura di embrioni
Dopo la rimozione del rivestimento del seme e il taglio trasversale dei cotiledoni si coltiva in vitro l’embrione.
Questa tecnica viene adottata per superare il grave problema dell’impoverimento, a seguito della selezione per il miglioramento genetico, del germoplasma delle specie coltivate e per recuperare quei caratteri, come resistenza ai parassiti, alla siccità ecc., che solo le specie selvatiche o quelle ad esse affini possiedono ancora. Inoltre, fenomeni di incompatibilità pollinestimma, endosperma difettosi, aborto dell’embrione non consentono di attuare in natura gli incroci tra specie selvatiche e coltivate.
Tali problemi vengono superati utilizzando le colture di embrioni e l’impollinazione e la fecondazione in vitro.
Numerosi sono gli esempi con risultati soddisfacenti: l’ibrido fra fagiolo comune e Phaseolus acutifolius possiede la tolleranza alla batteriosi Xanthomonas phaseolì; l’incrocio fra Lycopersìcum esculentum e Lycopersìcum peruvianum resiste al virus del mosaico, quello tra Cucurbita pepoCucurbita ecuadoriensis fornisce una zucchina resistente, come la zucchina selvatica, a numerose virosi. La coltura di embrioni permette anche di accorciare il ciclo di allevamento, di produrre piante aploidi ed è fonte per la formazione di callo.


Piante ibride di fagiolo tolleranti alla batteriosi moltiplicate in vitro (a). Sintomi di batteriosi da Xanthomonas phaseoli (b).


Colture embriogeniche in Zeamays: (a) calli embriogenici ottenuti da incrocio; (b) alta capacità rigenerativa delle colture embriogeniche; (c) embrioni somatici in fase di germinazione e rigenerazione; (d) coltura di mais derivante da pianta rigenerata in vitro.

Coltura di germogli, apici vegetativi, espianti, calli, singole cellule
È la tecnica più diffusa per ottenere un elevato numero di piante in tempi brevi (clonazione). L’epoca migliore per il prelievo dei germogli è quello che coincide con il periodo di massima vegetazione della pianta, ma può essere utilizzato anche materiale dormiente. In relazione al tipo di taglio si parla di coltura di germogli, di apici vegetativi, di espianti.
La coltura di callo si ha quando un tessuto differenziato produce un nuovo tessuto indifferenziato e si ottiene a seguito del taglio di un organo: ne è un esempio il callo ottenuto da frammenti di foglia di Saintpaulia o di Anthurium.
Le cellule si coltivano con l’aiuto di enzimi o di tecniche meccaniche. Durante la fase di moltiplicazione si selezionano, in assoluta asepsi, microtalee che vengono piantate in vitro.


Sviluppo di apice micropropagato da pianta di carciofo.
Coltura di meristemi
Si esegue per fini di prevenzione fìtosanitaria; i meristemi infatti sono gli unici tessuti della pianta esenti da virosi e, quindi, consentono di ottenere piante sane. La fase di prelievo viene condotta al microscopio sotto cappa a flusso laminare e consiste nell’espianto di un gruppo di cellule meristematiche da una gemma. È la tecnica d’elezione per la fragola e la patata, colture facilmente soggette ad attacchi virali.


(a) Coltura merisistematica di ananas sviluppata in mezzo liquido. Cultivar di asparago precoce d’Argenteuil (b) e ibrido maschile AM 723 (c), riprodotti per micropropagazione.

Coltura di antere e di ovari
La tecnica delle colture in vitro di antere o di ovari immaturi nacque dall’idea di poter meglio sfruttare le mutazioni positive che si verificano in alcuni geni o cromosomi.
Il rimescolamento genetico derivato dalla fusione dei gameti maschili e femminili, infatti, se da una parte rappresenta una fonte di variabilità genetica, risorsa principale dell’evoluzione e protezione dell’organismo da mutazioni dannose, dall’altra rende diffìcili l’individuazione e l’isolamento dei mutanti utili. Lo stato diploide delle piante, inoltre, rende il miglioramento genetico tradizionale lungo e laborioso e si calcola che con l’autofecondazione siano necessarie almeno 56 generazioni per ottenere la completa omozigosi dei caratteri. Colture di cellule e intere piante aploidi facilitano l’isolamento di mutanti e le tecniche di incrocio e selezione, poiché le mutazioni utili non vengono mascherate dalla copia del gene normale. L’utilità di tali piante è stata descritta fin dai primi anni del '900, ma il loro uso era limitato ai casi di aploidia spontanea, soprattutto nel frumento e nel mais.
Nel 1966 fu scoperta accidentalmente e descritta la rigenerazione di piante aploidi da colture di polline in vitro e oggi tale tecnica è stata realizzata per oltre un centinaio di specie vegetali tra cui il tabacco, l’orzo, la vite, il mais, il frumento, la patata, il riso. Di queste due ultime colture sono in circolazione varietà migliorate che derivano da piante aploidi. Il riso, in particolare, ha foglie più grandi e un peso in sostanza secca di circa il doppio del normale. Fra le colture ortive sono stati particolarmente studiati l’asparago e la melanzana. La tecnica consiste nei seguenti passaggi.
1.  Le antere immature vengono sottoposte a un trattamento a freddo per alcuni giorni, variabile a seconda della specie.
2.  Dalle antere vengono espiantate le microspore allo stadio mononucleato.
3.  Le microspore vengono trapiantate in terreno di coltura.
4.  Si forma un callo da cui si sviluppa la piantina.
5.  A volte il callo viene trapiantato in un nuovo terreno di coltura povero di auxine e di saccarosio.
Quando si vogliono ottenere piante diploidi, dopo aver identificato la mutazione utile, si può stimolare in vitro la duplicazione dei cromosomi utilizzando un farmaco, la col chicina. Si genera così una pianta fertile come una pianta normale in cui entrambe le copie di tutti i geni sono identiche.
Una tecnica simile si utilizza nelle colture degli ovari immaturi anche se, per il momento, è risultata meno efficiente della coltura di antere. Molto recentemente si è messa a punto tale tecnica per la cipolla: considerando che questa specie è allogama e biennale, e richiede lunghi tempi per conseguire un accettabile livello di omozigosi, l’induzione in vitro di aploidi apre nuove prospettive per il suo miglioramento genetico.

Il seme artificiale
La produzione di semi artificiali è una tecnologia relativamente nuova, ma con prospettive molto promettenti. La tecnica prevede fondamentalmente tre fasi:
1.  gli embrioni vengono prodotti in vitro attraverso colture di calli o cellule in mezzo liquido o solido;
2.  si pratica l’incapsulamento dell’embrione con alginato di calcio a cui vengono aggiunti anche fìtormoni, agrofarmaci, fertilizzanti e micorrize;
3.  si seminano su idonei substrati.
Con questa tecnica sono già state messe a punto procedure per le ornamentali, per la coltura di carota, sedano, melone e pomodoro, il cui interesse commerciale è indubbiamente più elevato.


Colture in vitro di antere immature: antere di orzo (a) e antere di vite con sviluppo di callo aploide (b) e diploide (c).

BIOLOGIA APPLICATA E BIOTECNOLOGIE AGRARIE
BIOLOGIA APPLICATA E BIOTECNOLOGIE AGRARIE
GENETICA, TRASFORMAZIONI, AGROAMBIENTE