BIOLOGIA APPLICATA E BIOTECNOLOGIE AGRARIE

3 Le fermentazioni

Il termine fermentazione deriva dal latino fervere che vuol dire “bollire", e fu usato per la prima volta nel 1815 da GayLussac che aveva osservato che una soluzione zuccherina produce, per azione di microrganismi, bolle di gas. Solo più tardi Pasteur dimostrò che dello sviluppo di gas erano responsabili i microrganismi che, in assenza di ossigeno libero, provocano un’importante decomposizione del terreno di coltura; fu così che definì la fermentazione come la "vita senz’aria".
Oggi il termine “fermentazione" è considerato in maniera più ampia ed è esteso a tutte le reazioni biochimiche indotte dai microrganismi e dagli enzimi da essi prodotti per ottenere la trasformazione di un substrato in assenza di ossigeno (fermentazioni propriamente dette) o in presenza di ossigeno (fermentazioni improprie).
A partire dagli anni '70 dello scorso secolo, con lo sviluppo delle biotecnologie innovative, il termine si è allargato a comprendere tutti i processi di coltivazione di microrganismi per produrre sostanze utili.
La presenza di microrganismi e degli enzimi da essi prodotti sono gli elementi fondamentali per dire che una trasformazione chimica è una fermentazione.
La produzione tradizionale del pane comune è possibile grazie alla fermentazione naturale dell’impasto (farina e acqua) dovuta a tantissime cellule di lievito (Saccharomyces cerevisiae) che in condizioni ottimali di temperatura si riproducono a velocità altissima. Il lievito madre, derivato dalla produzione tradizionale del pane, è l’antica alternativa al più moderno lievito di birra. Quest’ultimo è una massa formata da miliardi di cellule di lievito (.Saccharomyces cerevisiae) che si depositano alla base dei silos di fermentazione della birra e una volta raccolti sono depurati e lavorati a panetti (da qui il nome).


Fermentazione del pane portata a compimento dai lieviti.

Il lievito madre, o meglio ancora pasta madre (o impasto acido), è un impasto a base di farina, acqua e zuccheri che mescolati tra loro e rinfrescati con costanza, fermentano spontaneamente. Questa fermentazione ha come effetto visibile la produzione di anidride carbonica che fa aumentare il volume dell’impasto producendo delle bolle interne. Così nasce la pasta madre che però non è un concentrato di cellule di lievito, ma un sistema biologico complesso dove convivono lieviti e batteri lattici di differenti specie.

I lieviti

I lieviti sono Funghi unicellulari, circa dieci volte più grandi dei batteri. Le loro cellule sono eucariote e presentano una parete cellulare a protezione della membrana citoplasmatica.
Sono composti per il 75% da acqua e per il 25% da proti di, lipidi, glucidi e sali minerali (fosforo, soprattutto, ma anche potassio, magnesio, ferro, calcio...).


(a) Saccharomyces cerevisiae, il lievito sicuramente più usato per le fermentazioni applicate dall’uomo; (b) per la fermentazione dell’uva avviata alle prime fasi di vinificazione le cellule di lievito sono presenti sulla buccia per cui il processo di fermentazione si innesca in modo naturale. (c) Nella lievitazione del pane, la grande quantità di anidride carbonica prodotta conferisce alla pasta l’aspetto di una spugna.

Secondo la specie, i lieviti si sviluppano su una grande varietà di substrati naturali e artificiali e, nonostante esistano specie dannose e patogene, molte altre sono utili e pertanto coltivate e selezionate in ceppi di elevata purezza.
L’attività metabolica dei lieviti può svolgersi in presenza di ossigeno (metabolismo aerobico) e in assenza di ossigeno (metabolismo anaerobico).

Metabolismo e riproduzione
Durante il metabolismo aerobico il substrato, di solito uno zucchero, viene decomposto ad acqua e anidride carbonica e l’energia prodotta viene utilizzata dai lieviti per riprodursi. Quando l’ossigeno del mezzo si è consumato, il substrato viene decomposto parzialmente producendo alcol etilico e anidride carbonica e originando la fermentazione.
Perché le funzioni metaboliche si compiano, i lieviti hanno bisogno di sostanze nutritive disponibili e di condizioni ambientali adatte.


Metabolismo dei lieviti in presenza e assenza di ossigeno.

a) Fattori nutrizionali:
- zuccheri: le principali fonti di carbonio sono il glucosio, soprattutto, e il fruttosio. Possono essere utilizzati anche polialcoli come la glicerina o acidi organici (malico e citrico);
- azoto: in forma ammoniacale, amminoacidica e proteica;
- sali minerali (P, K, Ca) e vitamine.
L’insieme delle sostanze disciolte, in particolare gli zuccheri, influenza la pressione osmotica e, se questa è troppo elevata, provoca la plasmolisi delle cellule. Di solito i lieviti resistono a concentrazioni zuccherine fino al 30%, tranne gli osmofìli (Zigosaccaromiceti) che resistono fino al 60%.
b) Fattori ambientali:
- temperatura: l'optimum di temperatura è 2530 °C anche se vi sono lieviti che si accrescono al di sotto dei 10 °C e altri che sopravvivono a 50 °C;
- ossigeno: consente di far percorrere allo zucchero la via respiratoria (metabolismo aerobico
- pH: è preferibile che sia acido per favorire i lieviti e inibire i batteri;
- antifermentativi: tra tali sostanze, quella più usata è l’anidride solforosa alla quale sono sensibili in maniera diversa tutti i microrganismi, compreso i lieviti.

La riproduzione dei lieviti è agamica e avviene per gemmazione, tranne che nel genere Schyzosacchaiomycesche si divide per scissione.
In condizioni ambientali favorevoli ogni cellula dà luogo a due individui ogni 50 minuti circa e quindi in meno di tre ore una coltura di lievito duplica il suo contenuto.
La riproduzione sessuata può avvenire per ascospore portate da aschi nudi o per basidiospore cosicché anche i lieviti si classificano in Ascomiceti o Basidiomiceti.
Sono, perciò, comunemente detti lieviti sporigeni. Quando manca la forma sessuata i lieviti vengono inseriti nel gruppo dei Deuteromiceti e in questo caso sono detti lieviti asporigeni.
Solo Ascomiceti e Deuteromiceti inducono processi fermentativi.
In base alla forma si possono avere lieviti rotondeggianti ( Tomlopsis), a forma di limone (Apiculati: Kloeckera, Candida) o di ellisse (Ellittici: Sacchaiomyces).


Immagine a forte ingrandimento di cellula di lievito in accrescimento.


Cellule di Schizosaccaromices pombe, che si riproduce per scissione.


Generi di lieviti più importanti. Dei circa 60 generi e 500 specie di lieviti, i più importanti sono riportati di seguito.
Genere Saccharomyces1 Il lievito più importante per le fermentazioni di vino, birra e pane è il Saccharomyces cerevisiae. In questa specie ne confluiscono oggi ben 17 delle vecchie (ellypsoideus, bayanus, pastorianus, uvarum, ...) ritenute solo razze fisiologiche.
Genere Torulaspora2 (T. delbruckii e T. pretoriensis) Comprende anche la vecchia specie Saccharomyces rosei. È uno dei più importanti lieviti della fermentazione vinaria.
Genere Saccharomycodes3 Il S. ludwigii è dotato di alta resistenza all’anidride solforosa e ha grandi capacità fermentative.
Genere Schizosaccharomyces4 Sono i lieviti capaci di indurre la fermentazione maioalcolica (S. pombe).


Cellula di lievito del bgenere Torulaspora.


Saccharomyces ellypsoideus al microscopio elettronico.


Saccharomycodes ludwigii.

Genere Zygosaccharomyces5 Il Z. bailii e il Z. bisporus sono i cosiddetti “lieviti osmofili", capaci di resistere oltre il 60% di zuccheri senza essere inattivati. Producono però basse concentrazioni di alcol. Il Z. lactisentra, assieme ai batteri, fra i fermenti per la fabbricazione dello yogurt e del kefir.
Generi: Hanseniaspora e Kloeckera6
Sono i lieviti che iniziano la fermentazione, ma producono poco alcol. Hanno forma di limone (lieviti Apiculati) come la Candida.
Generi: Pichia, Hansenula, Candida7 Non hanno capacità fermentativa; devono essere eliminati, o inattivati, essendo responsabili di una malattia del vino, la fioretta, come per P. membranifaciens o C. mycoderma


(a) Cellule del genere Pichia. (b) Colonie di candida in formazione (fioretta).


Gli enzimi

Gli enzimi sono catalizzatori organici prodotti dalle cellule e hanno la proprietà di accelerare le reazioni chimiche agendo sulla loro velocità senza modificare le variazioni energetiche e senza apparire fra i prodotti delle reazioni.
Essi abbassano l'energia di attivazione che è la quantità di energia necessaria affinché si rompano i legami chimici dei reagenti e avvenga la reazione.


(a) Il classico esempio per visualizzare l’attività enzimatica è quello di paragonare gli enzimi all’azione svolta da un ponte: essi accelerano le reazioni chimiche proprio come un ponte velocizza la traversata di un fiume o di uno stretto. (b) Il grafico rende evidenza dell’attività enzimatica e di come l’enzima abbassi notevolmente l’energia di attivazione rappresentata dal gradino in salita delle due curve di reazione: la reazione con enzima necessita di minor energia iniziale e quindi procede più spedita.

Approfondimenti
Fattori che modificano l’attività enzimatica
Esistono diverse situazioni (fattori) che modificano la velocità di reazione:



In laboratorio
Gli enzimi sono catalizzatori, sostanze che accelerano o rallentano la velocità delle reazioni chimiche senza consumarsi e senza apparire fra i prodotti della reazione. Si vuole mettere in evidenza come la funzione da essi svolta sia influenzata dal calore e dal pH.

Calore
Occorrente: terriccio da giardino, fegato crudo di pollo, soluzione di amido 1%, albume d’uovo, H202, al 3%, crogiolo di porcellana, provette, saliva, becher, acqua distillata, pepsina 1%, cartine indicatrici di pH, termometro, soluzione di Benedict, liquido di Lugol, HCI 2M, bicarbonato di sodio.

Procedimento
Enzimi del terreno:
1)  pesare 5 g di terriccio e porli in un crogiolo di porcellana a fiamma bassa per 10 minuti;
2)  lasciare raffreddare e trasferire tutto in una seconda provetta (A);
3)  pesare altri 5 g di terriccio e porli in una seconda provetta (B);
4)  aggiungere a ciascuna provetta 5 mi di acqua ossigenata al 3%;
5)  confrontare lo sviluppo gassoso.

pH e calore
Pepsina:
1) mescolare energicamente albume d’uovo con acqua distillata fino a ottenere una sospensione;
2)  farla bollire alcuni minuti, agitando continuamente, fino a che sarà omogenea e lattiginosa;
3)  raffreddare;
4)  preparare 4 provette e procedere secondo lo schema mettendo in ciascuno:
Provetta 1 5 ml sospensione + 1 ml di pepsina all’ 1%;
Provetta 2 5 ml sospensione + 1 ml di pepsina all’ 1% + 3 gocce di HCI 2M (verificare il pH);
Provetta 3 5 ml sospensione + 1 ml di pepsina bollita;
Provetta 4 5 ml sospensione + 1 ml di pepsina all’1% + 1 ml di sodio bicarbonato al 5% (verificare il pH);
5)  riscaldare le provette a bagnomaria a 40 °C per 23 minuti;
6)  osservare.

Caratteristiche di un enzima
La sostanza su cui agisce un enzima prende il nome di substrato e i composti che si formano sono i prodotti di reazione. In natura esiste un numero enorme di enzimi. Secondo i criteri stabiliti dalla IUBNCE (International Union of Biochemistry on Nomenclature and ClassiScation ofEnzymed) il loro nome è così composto: nome del substrato attaccato, più nome della reazione catalizzata, più il suffisso finale asi. Per esempio: latticodeidrogenasi, ribulosio 1,5 difosfato carbossilasi.
Restano ancora in uso le vecchie terminologie, che indicano solo il substrato (proteasi, lipasi, amilasi) o la reazione che catalizzano (idrolasi, transaminasi). Gli enzimi vengono prodotti all’interno delle cellule e poi eventualmente secreti. Sono proteine semplici o più spesso coniugate. In questo caso l’enzima risulta formato da una parte proteica, apoenzima, e da una non proteica (prostetica) detta coenzima o cofattore. L’apoenzima, essendo una proteina, è termolabile, e questo spiega l’inattivazione con il calore degli enzimi. La parte prostetica può essere una molecola organica più o meno complessa (vitamina, amminoacido), o semplicemente uno ione metallico.

Specificità di un enzima
È una caratteristica molto importante che differenzia gli enzimi dai catalizzatori inorganici: un enzima catalizza un numero molto limitato di reazioni, il più delle volte una sola reazione. La causa è da attribuire al fatto che l’enzima per reagire con il substrato deve legarsi ad esso con un numero variabile di legami (maggiore è il numero dei legami da comporre, maggiore è la specificità) in una sede ben precisa e limitata: sito attivo.
Il complesso enzimasubstrato, responsabile dell’abbassamento dell’energia di attivazione, si forma con un meccanismo di chiaveserratura (descritto da Fisher nel 1884) o di adattamento indotto (descritto da Koshland nel 1973).

Fermentazioni propriamente dette

In senso stretto la fermentazione è il catabolismo anaerobico di sostanze organiche, di natura glucidica, ad opera di enzimi microbici; le fermentazioni possono essere suddivise in:
- omofermentative -se il prodotto finale è unico (alcol etilico nella fermentazione alcolica);
- eterofermentative -se il prodotto è più di uno (acido lattico, alcol etilico nella fermentazione eterolattica).

Oppure, a seconda del substrato che trasformano, si distinguono in:
 zucchero -fermentazione alcolica, fermentazione lattica, fermentazione acetonbutilica, fermentazione mannitica;
 acido lattico -fermentazione propionica, fermentazione butirrica;
 acido malico -fermentazione maiolattica, fermentazione maioalcolica;
 acido tartarico -fermentazione tartarica.
Se il substrato è lo stesso, ad esempio lo zucchero, la diversità del prodotto finale sta nella molecola organica che, accogliendo H ed elettrone, si riduce consentendo l’ossidazione dell’NADH a NAD+, indispensabile a far procedere la glicolisi.







Fermentazione alcolica
È la più antica e la più importante trasformazione degli zuccheri utilizzata dall’uomo per produrre vino, birra e pane. I lieviti (Saccharomyces cerevisiaè) sono i microrganismi responsabili ed il substrato è sempre uno zucchero: uno zucchero semplice (glucosio, fruttosio nelle uve) o amido (nell’orzo e nel grano). Nel caso dell’amido il processo fermentativo deve essere preceduto dall’idrolisi del polisaccaride in molecole di monosaccaridi semplici (glucosio).
L’equazione generale di fermentazione è:



La resa in alcol è in media del 60% in volume; da 1 mole di glucosio (180 g), infatti, si producono 2 moli di alcol etilico (92 g) pari a 0,51 in peso che, dividendo per il peso specifico dell’alcol (0,79), è uguale a 0,64 in volume (64%).
La quantità di calore è di 24 kcal ogni mole di glucosio. In teoria la temperatura del mosto, che in media contiene il 1518% di zuccheri, aumenterebbe fortemente con la fermentazione, più di 20 °C rispetto alla temperatura iniziale, con gravi danni per i lieviti che, inibiti dalle alte temperature raggiunte, sarebbero sostituiti dai batteri con fermentazioni indesiderate (fermentazione mannitica). In pratica, il mosto quando fermenta non è isolato dall’esterno e quindi si ha dispersione di calore favorita anche da operazioni quali follature (rimescolamento del mosto), rimontaggi (il mosto viene prelevato dalla parte bassa del recipiente e lasciato ricadere a pioggia) o refrigerazione, che raffreddano l’intera massa. Anche la liberazione dell’anidride carbonica (nel vino appena fatto ne rimane circa 1 g/1) favorisce, in parte, il raffreddamento della massa in fermentazione.
Il processo biochimico, riassunto nell’equazione fondamentale precedente, si svolge in numerosissime tappe fino all’acido piruvico che, in ambiente anerobico, anziché prendere la strada del ciclo di Krebs, viene decarbossilato ad aldeide acetica e quindi ridotto ad alcol etilico con riossidazione dell’NADH che, tornando NAD+, può rientrare in circolo.
Nel processo di fermentazione del pane dall’amido idrolizzato si forma l’acido piruvico e da esso alcol etilico ed anidride carbonica (è la CO, a far lievitare il pane), ma dall’acido piruvico si formano anche glicerina, aldeide acetica, acidi organici (acido succinico), alcoli superiori (dagli amminoacidi). Contemporaneamente si possono avere anche altre fermentazioni acide sostenute dai lattobacilli, quali l’acetica e la lattica che sembra migliorino il sapore del pane e di altri prodotti da forno come il panettone. Sono allo studio tecniche per realizzare fermentazioni miste, in cui ai lieviti viene associato il Lactobacillus sanfranciscensis.

Fermentazione lattica
Quando lo zucchero (lattosio), anziché dai lieviti, viene demolito da batteri (quali Lattobacilli o Streptococchi), si ha la trasformazione fino ad acido piruvico come nel caso precedente, ma poi questo viene ridotto direttamente, senza essere decarbossilato, e così si forma acido lattico (fermentazione omololattica). Se i batteri sono del genere Leuconostoc, oltre ad acido lattico si producono anche alcol etilico e anidride carbonica (fermentazione eterolattica). Tale fermentazione è sfruttata dall’industria lattierocasearia nel processo di maturazione dei formaggi e nella tecnologia di produzione di yogurt (fermentazione omolattica) e kefir (fermentazione eterolattica). Molte verdure possono essere conservate con questa tecnologia: i crauti del Trentino sono cavoli cappucci lavati, affettati e deposti a strati con il sale in un alto contenitore, pressati e lasciati fermentare, prima a temperatura ambiente, poi al fresco di una cantina per 34 settimane. Il prodotto può così conservarsi per parecchi mesi. Molti alimenti fermentati vengono considerati veri e propri medicinali naturali, utili nei disordini intestinali e nella dissenteria per inattivare o uccidere i batteri patogeni e ripristinare la flora microbica saprofita.
Anche negli esseri umani si può avere produzione di acido lattico nei muscoli quando, a seguito di intenso esercizio fìsico, può non esserci l’ossigeno sufficiente ad ottenere tutti gli ATP che di norma si ottengono dall’ossidazione completa del glucosio.
Si accumula così l’acido lattico (per riduzione ad opera dell’NADH dell’acido piruvico) che è causa di quella sensazione di rigidità e spossatezza che si avverte dopo una corsa. Sensazione che cessa solo quando, ripristinate le condizioni di aerobiosi grazie a un apparato circolatorio efficiente, l’acido lattico viene allontanato dal muscolo. Ecco lo scopo dell’allenamento: quello di mantenere in efficienza l’apparato circolatorio.


Il mosto è oramai trasformato quasi totalmente in giovane vino, quasi tutto lo zucchero è stato trasformato in alcol e si può procedere con la svinatura e le successive fasi della vinificazione


I lattobacilli, maggiori responsabili della fermentazione lattica, sono anche parte integrante della flora batterica intestinale.

Fermentazione acetonbutilica
Fu scoperta durante la prima guerra mondiale. Avviene ad opera del Clostridium acetonbutylicum che trasforma il glucosio in acetone, butanolo, anidride carbonica, alcol etilico, isopropanolo. La scoperta di questo tipo di fermentazione, dall’inizio del 1900, permise la produzione di butanolo (usato per la produzione di gomma sintetica) e di acetone (usato anche come solvente per la produzione di esplosivi durante la prima guerra mondiale).

Fermentazione propionica
Il Propionbacterium fermenta l’acido lattico con produzione di acido propionico, acido acetico e anidride carbonica. Sono i microrganismi di questo gruppo a determinare gli “occhi tipici dei formaggi svizzeri Emmental e Gruyère.


Emmental con le caratteristiche occhiature prodotte dai batteri propionici.

Fermentazione butirrica
È sostenuta dal Clostridium tyrobutyrricum che fermenta l’acido lattico in acido buttirrico, acido acetico, anidride carbonica e idrogeno.
I microrganismi del genere Clostridium sono frequenti nei foraggi male insilati o nel terreno (la specie C. botulinum produce una tossina venefica) e, resistenti al calore, sopravvivono ai trattamenti di risanamento del latte che sarà poi sottoposto a caseificazione.
Può capitare che si sviluppino, anche insieme al Propionbacterium, nei formaggi (parmigiano reggiano o grana padano) durante la lunga maturazione, causando alterazioni note come gonfiore tardivo.

Fermentazioni tipiche dell’industria enologica

Vengono indicate con il termine “fermentazione" anche alcune importanti trasformazioni che avvengono nell’industria enologica: la prima è un momento fondamentale di trasformazione del vino durante la fermentazione lenta, le altre appartengono al gruppo delle malattie o delle fermentazioni non desiderate.

 Fermentazione malolattica - È sostenuta dai batteri lattici Lactobacilluse Leuconostoc che, in primavera quando la temperatura si alza, trasformano l’acido malico presente nel vino in acido lattico (l’acido malico viene prima ossidato, poi decarbossilato e ridotto).
Il vino in questo modo “matura", si riduce l’acidità fìssa e il gusto diviene più morbido. La fermentazione maiolattica è quindi un momento importante nella tecnologia enologica. Non è così lo spunto lattico, un’alterazione causata sempre dai batteri lattici che oltre all’acido malico attaccano anche gli zuccheri residui provocando un aumento dell’acidità volatile ed uno scadimento delle caratteristiche organolettiche: il vino non merita più di essere destinato all’invecchiamento.
 Fermentazione maioalcolica - Anche questa reazione riduce l’acidità del vino, ma ne aumenta di poco il grado alcolico (infatti l’acido malico viene decarbossilato due volte e ridotto ad alcol etilico). A sostenerla è lo Schizosaccharomycespombe, che però viene spesso inattivato dagli altri Saccharomyces e non riesce a portare a termine la sua fermentazione, peraltro nel complesso negativa perché altera la conservabilità e le caratteristiche organolettiche del prodotto finito.


Il perfetto controllo di tutti i processi fermentativi garantisce dallo sviluppo di difetti e alterazioni che possono compromettere la corretta maturazione del vino: esso può essere così destinato anche a un lungo invecchiamento.

 Fermentazione mannitica - Viene definita in questo modo una temuta malattia, nota anche con il nome di “agrodolce", alla quale può andare incontro il vino.
Ne è responsabile il Bacterìum mannitopoem che trasforma gli zuccheri ancora presenti nel vino:
- il glucosio in acido lattico, acetico, succinico, anidride carbonica;
- il fruttosio in mannite.
Gli acidi conferiscono il gusto amaro “agro", la mannite il gusto “dolce".
 Fermentazione tartarica - Anche questa è una malattia del vino, detta “girato, cui sono esposti vini che hanno ancora un buon residuo zuccherino o derivano da uve ammuffite. Il Bacterìum tartarophtorum demolisce l’acido tartarico, poi anche gli altri acidi e gli zuccheri producendo acido acetico e lattico. Il vino diviene “svanito e dal sapore di aceto.

Fermentazioni improprie

Sono dette impropriamente fermentazioni perché avvengono in presenza di ossigeno. Si tratta di processi di ossidazione che, se avvengono in maniera completa, demoliscono il substrato a H2 0 e CO2; nel caso di demolizione incompleta si ottengono prodotti diversi utilizzati nell’industria alimentare.

Fermentazione acetica

Per azione dell’Acetobacter l’alcol etilico viene ossidato ad acido acetico. Lasciando il vino a contatto con l’aria è facile che insorga questa malattia. Il vino perde corpo e acquisisce il gusto tipico dell’aceto dovuto, però, non all’acido acetico dal sapore acre, ma alla formazione di esteri (acetato di etile), eteri, alcoli volatili. Se la fermentazione è solo iniziale è nota come spunto, se lo stadio è avanzato come acescenza.
La fermentazione acetica viene utilizzata nella produzione dell’aceto ottenuto da vino, sidro di mele, birra, malto. Con processi tecnologici artigianali o industriali si attua la lenta trasformazione del vino ad opera della “madre, aceto pronto o in formazione che contiene l'Acetobacter. Un periodo di maturazione e invecchiamento consente la formazione di tutte quelle sostanze volatili che gli conferiranno ottime caratteristiche organolettiche.


(a) Alcune confezioni di aceto. (b) Madre dell’aceto di diversi anni: si notano i vari strati di accrescimento delle popolazioni batteriche. (c) Cellule al microscopio di Acetobacter aceti.

Fermentazione citrica

È condotta da muffe come YAspergillus niger , allevate su substrati zuccherini tipo la melassa. In presenza delle muffe di Aspergillus, vengono inattivati alcuni degli enzimi del ciclo di Krebs e si accumula acido citrico.
Questa fermentazione è utilizzata, appunto, per la produzione di acido citrico.


Conidioforo portante le spore riproduttive di Asperillus niger (muffa nera).

Approfondimento
In laboratorio
Fermentazione alcolica
I microrganismi si accrescono utilizzando i substrati disponibili e li trasformano producendo alcol, gas, acidi. Si vuole verificare la formazione di alcuni prodotti.
Occorrente: lievito di birra fresco, terreno di coltura A (sciogliere in 1 litro d’acqua 20 g di zucchero, 10 g di peptone, 3 g di KH2P04, 3 g di MgS04), terreno di coltura B (acqua e zucchero, NH4H2P04, K2S04) provettone, tubicino da saggio, matraccio da 11, beuta, capsula di porcellana, apparecchio di distillazione, acqua di barite, beuta chiusa con tappo forato, manometro ad acqua costituito da un tubo capillare a U, thermos, blu di bromotimolo.

Preparazione dei terreni di coltura
Terreno A: 1) preparare il terreno di coltura e fare sciogliere scaldando a bassa temperatura; 2) versare in un provettone; 3) sterilizzare; 4) passare alla fiamma un tubicino da saggio; 5) lasciarlo raffreddare e disperdere con un’ansa il lievito attorno alle pareti; 6) porre il tubicino capovolto nel provettone contenente il terreno e agitare in modo che non rimanga aria al suo interno; 7) mantenere al caldo (2530 °C) per alcuni giorni; 8) quando lo zucchero fermenta, lo sviluppo di C02 farà innalzare il tubicino o formerà bollicine di gas al suo interno.

Terreno B: 1) mettere in un matraccio da 11 500 mi di acqua, 70 g di zucchero, 15 g di lievito di birra fresco già sciolto in poca acqua, 2 g di fosfato di ammonio e 1 g di solfato di potassio; 2) mantenere al caldo (2530 °C) per alcuni giorni.
Verifica che durante la fermentazione si produce calore: a) Inserire terreno di coltura e lievito di birra in un termos chiuso con un tappo di gomma forato in modo da poter contenere un termometro; b) verificare ad intervalli di tempo regolari il progressivo aumento della temperatura.

Verifica che durante la fermentazione si forma anidride carbonica: in un matraccio mettere un quarto di bustina di lievito di birra liofilizzato (circa 2 g) e aggiungere circa 100 mi di acqua tiepida e lo zucchero; b) chiudere il matraccio con un tappo di gomma forato in cui sia inserito un tubicino a U. Metodo I: a) immergere l’altra estremità del tubicino in un becher in cui sia contenuta acqua di barite; b) osservare l’intorbidimento dovuto alla reazione della C02 con Ba(0H)2. Metodo II: a) far pescare l’estremità del tubicino nell’acqua contenente blu di bromotimolo e quindi di colore blu; b) osservare il viraggio da blu a giallo causato dall’acidificazione dell’acqua dovuta all’anidride carbonica.

Verifica che durante la fermentazione si forma alcol: a) mettere nel matraccio in cui si è verificata la presenza di C02 qualche pezzetto di pietra pomice per regolarizzare l'ebollizione; b) collegarlo al refrigerante di un apparecchio di distillazione; c) accendere la fonte di riscaldamento sotto l’apparecchio di distillazione; d) attendere che si formi all’altro capo del refrigerante il distillato che verrà raccolto in una beuta; e) prelevare i primi 10 mi di distillato e metterli in una capsula di porcellana; f) accendere con un fiammifero. Il distillato brucerà facilmente con fiamma bluastra.

Verifica che solo gli organismi vivi compiono la fermentazione: a) portare ad ebollizione per 10 minuti 20 g di lievito di birra in un litro di acqua in modo da uccidere i microrganismi; b) inserire il liquido in uno dei due terreni di coltura; c) ripetere i passaggi precedenti (prove 1, 2, 3) per le verifiche di controllo.
Fermentazione lattica
La fermentazione lattica avviene ad opera di due batteri: Lactobacillus casei e Streptococcus casei: il primo fermenta lo zucchero del latte con produzione di acido lattico, il secondo altera le proteine del latte formando il caglio.
Occorrente: una busta di latte un vasetto di yogurt o fermenti lattici, un fornello, un recipiente in pyrex, cristal violetto, occorrente per microscopia e microscopio.
Procedimento: 1) portare ad ebollizione il litro di latte in un recipiente di pyrex; 2) lasciarlo raffreddare, tenendolo coperto, fino alla temperatura di 37/40 °C.
3) aggiungere 2 o 3 cucchiai di yogurt o dei fermenti lattici e mescolare; 4) ricoprire il recipiente, avvolgendolo con un panno per evitare che si raffreddi troppo in fretta; 5) il giorno dopo osservare il composto cremoso formatosi; 6)  prelevarne una goccia e stemperarla su un vetrino portaoggetti; 7) riscaldarla fino a che il vetrino non è completamente essiccato; 8) aggiungere alcune gocce di “cristal violetto” per evidenziare i batteri; 9) lasciare agire per alcuni secondi; 10) lavare e mettere qualche goccia di glicerina; 11) coprire col coprioggetti e osservare al microscopio. I lattobacilli appaiono come lunghi bastoncini, gli Streptococchi come file di piccole sfere concatenate.

Lievitazione
Occorrente: lievito di birra, farina, becher o altro recipiente graduato.
Procedimento: 1) sciogliere una piccola quantità di lievito di birra in acqua calda e fare un impasto con la farina in modo da formare un cubetto di 1 cm di lato; 2) fare un impasto delle stesse dimensioni, ma solo con acqua e farina; 3) porre i due cubetti nel recipiente graduato in luogo caldo; 4) osservare le modificazioni delle masse col passare del tempo.

Verifiche

Domande a risposta aperta
Rispondi in tre righe alle seguenti domande.
1.    Cosa si intende per biotecnologie tradizionali?
2.    Cosa è il miglioramento genetico?
3.    Cosa è la selezione?
4.    Come si applica la selezione nelle piante autogame?
5.    Come si applica la selezione nelle piante allogarne?
6.    Come si applica la selezione nelle piante a propagazione vegetativa?
7.    Cosa sono l’inincrocio e l’esoincrocio?
8.    Cosa è l’ibridazione?
9.    Cosa si intende per lussureggiamento degli ibridi?
10.   Cosa è l’ibridazione interspecifica?
11.   Cosa sono gli ecotipi?
12.   Cosa si intende per cline?
13.   Cosa sono le fermentazioni?
14.   Come agiscono gli enzimi?
15.   Cosa sono i lieviti?
16.   Quali sono gli elementi fondamentali per dire che una trasformazione chimica è una fermentazione?
17.   Come si classificano le fermentazioni?
18.   Come avvengono la fermentazione alcolica, lattica, propionica, butirrica, acetonbutilica?
19.   Quali fermentazioni interessano l’industria enologica?
20.   Cosa sono le fermentazioni improprie?

Scegli la risposta esatta
1.    Si cerca di migliorare l’intensità di un carattere che interessa attraverso la tecnica della
- mutazione
- ibridazione 
- selezione
2.    Si ottengono individui che per la maggior parte possiedono omozigosi per il carattere desiderato attraverso la tecnica
- esoincrocio
- inincrocio
- eterosi
3.    La selezione fatta fra pochi individui e che origina una estrema uniformità nei discendenti prende il nome di
- selezione di massa
- selezione per linea pura
- selezione per eterozigosi
4.    Le varietà standardizzate con i caratteri omozigoti desiderati possono presentare
- lussureggiamento degli ibridi
- depressione da inincrocio
- caratteri di massa
5.    Gli ibridi si ottengono mediante
- inincrocio
- esoincrocio
- omozigosi
6.    Con l’eterozigosi si verifica
- la sostituzione dei geni alterati con geni diversi
- la standardizzazione dei geni 
- varietà con geni identici a quelle da cui derivano
7.    Con l’ibridazione interspecifica avviene
- l'incrocio fra individui della stessa specie
- l'incrocio fra individui di varietà diverse 
- l'incrocio fra specie o generi diversi
8.    Nelle piante come negli animali, possono comparire nuovi caratteri derivati da
selezioni
ibridazioni 
mutazioni
9.    Dall’incrocio di una cavalla e un asino si ottiene
- il mulo
- il bardotto
- nessuno di questi
10.    La selezione che porta a creazione di nuove cultivar è detta
- conservatrice
- costruttrice 
- miglioratrice
11.    La fermentazione alcolica è propria di organismi
aerobi
anaerobi
che fissano l'azoto
12.    All’aumentare della concentrazione del substrato la velocità di reazione enzimatica
- aumenta
- diminuisce 
- resta costante
13.    Gli enzimi sono
- acidi nucleici
- proteine
- zuccheri
14.    I lieviti sono
enzimi
batteri
funghi
15.    La funzione degli enzimi è
- permettere
- catalizzare
- inibire
16.    Per produrre pane è utilizzata la fermentazione
- lattica
- alcolica
- nessuna di queste
17.    La fermentazione acetica è una fermentazione
- propria
- impropria
- apparente
18.    La fermentazione mannitica è causata da
- enzimi
- lieviti
- batteri
19.    Gli “occhi” dei formaggi Emmental sono prodotti da fermentazione
- propionica
- aceton butilica
- maiolattica
20.    Lo yogurt deriva da fermentazione
- butirrica
- lattica
- maiolattica

Rispondi con Vero/Falso
1. Con la selezione si migliora l’intensità di un carattere.........V F
2. Il mulo è un esempio di ibridazione interspecifica...............V F
3. L’eterosi deriva dalla selezione.................................V F
4. Con inincrocio si ottiene omozigosi..............................V F
5. Gli ibridi che derivano dall’incrocio intraspecifico
sono sterili........................................................V F
6. La selezione massale è una selezione miglioratrice...............V F
7. Nelle piante autogame si produce eterozigosi.....................V F
8. Le piante autogame sono adatte a un unico ambiente...............V F
9. Le selezione viene usata per produrre
varietà con nuove caratteristiche...................................V F
10. La selezione si applica in base alla
modalità di riproduzione............................................V F
11. Tutte le fermentazioni sono causate da lieviti..................V F
12. La fermentazione alcolica è causata da saccaromiceti............V F
13. La fermentazione tartarica serve a
produrre alcuni tipi di formaggi....................................V F
14. La fermentazione citrica è condotta da muffe....................V F
15. Le fermentazioni improprie avvengono
in presenza di ossigeno.............................................V F
16. Nella fermentazione alcolica si trasforma
zucchero in alcol...................................................V F
17. Lieviti e enzimi sono la stessa cosa............................V F
18. Con la fermentazione butirrica si
produce burro.......................................................V F
19. Una specie coltivata adatta all’ambiente
in cui vive è l’ecotipo.............................................V F
20. Il cline non varia al variare delle
condizioni ambientali...............................................V F

BIOLOGIA APPLICATA E BIOTECNOLOGIE AGRARIE
BIOLOGIA APPLICATA E BIOTECNOLOGIE AGRARIE
GENETICA, TRASFORMAZIONI, AGROAMBIENTE