Capitolo 1 I fondamenti della biologia

Capitolo 1 - I fondamenti
della biologia





Traccia dei contenuti
1 Tecniche per lo studio delle strutture biologiche
- Indagine dei componenti molecolari
2 La cellula
- Cellula procariote
- Cellula eucariote
3 Acidi nucleici e codice genetico
- Il DNA
- L’RNA
4 Geni, cromosomi e genoma
5 La sintesi delle proteine
- Trascrizione
- Traduzione
6 La regolazione dell’espressione genica
- Regolazione genica nei procarioti
- Regolazione genica negli eucarioti
7 La continuità dei viventi
- La replicazione del DNA
- Divisione cellulare e riproduzione
8 La trasmissione dei caratteri: le leggi di Mendel
- Prima legge di Mendel o legge della dominanza
- Seconda legge di Mendel o legge della segregazione
- Test cross
- Terza legge di Mendel o legge della indipendenza
9 Eredità multifattoriale
- Interazione fra alleli
- Interazione fra geni
- Interazione geniambiente
- Mappaggio genico: linkage e marcatori
10 Le mutazioni
- Mutazioni a livello genico (puntiformi)
- Mutazioni cromosomiche
- Mutazioni


In sintesi
I concetti fondamentali della biologia cellulare e molecolare (dalla struttura delle cellule procariote ed eucariote e del materiale genetico DNA, RNA al collegamento tra geni e proteine, ai meccanismi della riproduzione e dell’ereditarietà biologica) probabilmente sono già stati acquisiti durante gli anni precedenti. Data però la loro importanza per la comprensione delle applicazioni biologiche e delle biotecnologie, sia tradizionali che innovative, vengono in questo Capitolo ugualmente richiamati alla memoria come un’occasione di ripasso e revisione degli argomenti base.
Abstract
Chapter 1 - The basics of biology
The basic concepts of cellular and molecular biology (from thè prokaryotic and eukaryotic cells structure and thè gene pool structure DNA and RNAto thè link between genes and proteins, to the reproduction process and thè biological heredity) have probably been learned during thè previous years, but, given their importance for thè understanding of both traditional and innovative biological applications and biotechnologies, they are recalled as an opportunity of review and revision of basic topics.

Tecniche per lo studio delle strutture biologiche

Per indagare nel mondo invisibile, lo strumento tipico del biologo è il microscopio grazie al quale non solo le immagini appaiono ingrandite, ma anche due punti che a occhio nudo potrebbero apparire come un solo punto appaiono separati. Il microscopio è stato inventato nel XVII secolo dall’olandese Leeuwenhoek e da allora questo strumento è stato continuamente perfezionato e utilizzato per studiare strutture diverse fra loro. Quelli più usati in biologia, oggi, sono il microscopio ottico composto e il microscopio elettronico. Il microscopio ottico composto permette di ottenere immagini comprese fra 200 e 10001500 ingrandimenti.
Il microscopio elettronico offre ingrandimenti delle immagini di 100.000 volte e tali immagini possono essere sottoposte a un ulteriore ingrandimento di 1.000.000 di volte con la fotografia. I preparati vengono attraversati da un fascio di elettroni e l’immagine è fissata su una lastra fotografica. Mentre col microscopio ottico possiamo osservare le cellule, col microscopio elettronico giungiamo a scoprire le strutture che si trovano nelle cellule e anche a distinguere alcune grosse molecole. Per l’osservazione della superficie cellulare è utilizzato il microscopio elettronico a scansione. I preparati devono essere sottilissimi e perciò si usa uno strumento detto microtomo; in microscopia si usano le seguenti unità di misura:
   - Mm (micrometro) = 106 ;
   - nm (nanometro = 1O9 ;
   - A° ( angstrom ) = 1O10.


1 (a) Rappresentazione storica del microscopio ottico di R. Hooke (London, 1664). Il microscopio ottico (b) è fondamentale per un’analisi rapida dei campioni. Distanze dell’ordine del μm possono essere agevolmente apprezzate su campioni planari. Il massimo ingrandimento disponibile è di circa 4000x. La trasmissione con microscopio elettronico TEM (c) opera fino a 200 kV e può raggiungere una risoluzione di 2 Angstrom con campioni ultrasottili. Nella foto, postazione con microscopio elettronico e scansione di Natrialba magadii, batterio estremofilo, che insieme a Deinococcus radiodurans ha dimostrato di essere l’unico a resistere alle radiazioni cosmiche.

Indagine dei componenti molecolari

I cristalli delle grosse molecole che si trovano nelle strutture cellulari vengono esplorati attraverso il difrattometro, strumento a raggi X, e la tecnica usata prende il nome di difrattometria.
La natura dei vari componenti della cellula si analizza con la tecnica del frazionamento: le cellule vengono prima rotte con mezzi meccanici o chimici e poi poste in appositi strumenti chiamati centrifughe che, ruotando a fortissima velocità, separano le varie componenti in base alle loro dimensioni e forme e quando sono stratificati su una soluzione di saccarosio al 520%: a 800 g per 10 min sedimentano i nuclei; a 15.000 g per 10 min del sopranatante sedimentano mitocondri, lisosomi e perossisomi; a 100.000 g per 60 min del sopranatante sedimentano i frammenti di membrana e del reticolo endoplasmatico; la centrifugazione del sopranatante a 200.000 g per 3 ore fa sedimentare i ribosomi. Il campione contenente componenti subcellulari, come lisosomi, perossisomi e frammenti di membrana, è posto in provette che sono inserite in un anello di fori cilindrici disposti su un rotore metallico che, muovendosi rapidamente, genera enormi forze centrifughe in grado di provocare la sedimentazione delle particelle.

Poiché il rotore è sotto vuoto, non si crea attrito e si impedisce il riscaldamento. Un sistema di refrigerazione mantiene il campione a 4 °C. Un’ulteriore purificazione dei vari componenti si ottiene mediante la centrifugazione in gradiente di densità in cui gli organuli vengono separati per sedimentazione attraverso un gradiente di una sostanza densa come il saccarosio.
Un altro metodo per separare le singole sostanze consiste nello sfruttare le loro diverse proprietà chimicofìsiche attraverso la cromatografìa o l’elettroforesi. Molecole cariche, come acidi nucleici e proteine, possono essere separate mediante elettroforesi (migrazione in un campo elettrico). Essendo cariche negativamente, le molecole di DNA migrano verso il polo positivo. In una matrice porosa la velocità di migrazione del DNA è inversamente proporzionale al LOG1O della sua lunghezza.
Al termine dell’elettroforesi, DNA di lunghezza diversa sono risolti in bande distinte.
Attraverso questa stessa tecnica si determinano le dimensioni e la composizione in subunità di una proteina, mentre per identificare una particolare proteina in una miscela di proteine si ricorre all’utilizzo della corsa elettroforetica su gel di un anticorpo specifico primario e di uno secondario coniugato con un enzima che rivela un segnale colorimetrico. Questa tecnica si chiama western blotting o immunoblotting.
Con tecniche simili si analizzano frammenti di DNA (Southern blotting) o di RNA (Northern blotting).
I marcatori usati comunemente comprendono fluoresceina o rodamina (per la microscopia a fluorescenza), l’enzima perossidasi di rafano (per la microscopia ottica convenzionale o per la microscopia elettronica) e l’enzima fosfatasi alcalina o perossidasi (per la rivelazione biochimica).
Un altro metodo indispensabile per marcare le molecole biologiche è l’uso di radioisotopi. In questi elementi, detti anche isotopi radioattivi, il nucleo è instabile e subisce degradazioni nel corso delle quali vengono emesse particelle subatomiche provviste di energia come gli elettroni (particelle p) o radiazioni come i raggi y.
Per sapere se una molecola è stata radio marcata si misura la sua attività specifica con lo scintillatore e si analizza la quantità di radioattività per unità di materiale, valutata in quantità di degradazioni per millimoli al minuto.
Le molecole marcate con radioattivo possono essere evidenziate con l’autoradiografìa, tecnica che si usa anche per scoprire il movimento delle sostanze dentro la cellula. Le radiazioni emesse impressionano una lastra speciale formando aree più scure che indicano la localizzazione della sostanza.
Lo studio delle interazioni cellulari e delle proprietà dei tessuti si evidenzia con le colture di cellule in vitro. Per analizzare i dati biologici che descrivono le sequenze di geni, la composizione e struttura delle proteine, i processi biochimici nelle cellule, nonché le interazioni di tutti i componenti all’interno di un organismo, si utilizzano gli strumenti informatici e la nuova scienza prende il nome di bioinformatica; essa si occupa principalmente di:
- identificare tendenze e leggi numeriche fornendo modelli statistici con i quali interpretare i dati provenienti da esperimenti di biologia molecolare e biochimica;
- creare un corpus di conoscenze relative alla frequenza di sequenze di DNA, RNA e proteine attraverso modelli e strumenti matematici sempre più nuovi;
-  rendere accessibili a tutti i dati acquisiti sul genoma a livello globale, organizzando le conoscenze e ottimizzando gli algoritmi di ricerca dei dati stessi per migliorarne l’accessibilità;
- simulare i processi biologici ottenendo grandi vantaggi in termini di riduzione di lavoro sperimentale in laboratorio non solo a livello di tempo, ma anche di costi: è possibile stimare la validità degli esperimenti e gli eventuali effetti positivi o negativi prima di portarlo a termine oppure valutare quale fra le opzioni di lavoro possibili è la migliore o la più efficace;
- permettere il confronto (microarray) di interi profili genici per indagini conoscitive e diagnostiche;
- costruire delle banche dati biologiche in modo tale da mettere a disposizione dei ricercatori collezioni di informazioni (sequenze nucleotidiche, proteine, geni, genomi, ecc.), organizzate per facilitare l’accesso casuale, la ricerca ed eventualmente l’utilizzo a fini statistici.


2 Esiti di indagine sul DNA tramite: (a) cromatogramma DNA; (b) elettroforesi



3 Possibili applicazioni della bioinformatica.

La Cellula

L’enunciato della teoria cellulare, formulata nel 1839 dai due scienziati tedeschi Matthias Jacob Schleiden, botanico, e Theodor Schwann, zoologo, è in sintesi: “La cellula è l’unità funzionale di tutti gli organismi viventi. Tutti gli esseri viventi sono fatti di cellule e da prodotti dell’attività di queste.
L’uso del nome cellula però è molto più antico della teoria cellulare: fu infatti proposto per la prima volta da Robert Hooke, nel 1665, per denominare la struttura a minuscole celle vuote (in latino cellulae) che era possibile vedere osservando al microscopio una sottile fettina di sughero.
Nacque così la scienza della microscopia che confermò, attraverso moltissime osservazioni di innumerevoli preparati, che la cellula è l'unità fondamentale della materia vivente.
Il frazionamento della materia vivente in tante piccole unità permette, a parità di volume, di aumentare notevolmente la superfìcie di scambio con l’ambiente esterno.
Pertanto, per conoscere gli esseri viventi occorre studiare la cellula, che è la più piccola forma di vita che mantiene esattamente tutte le caratteristiche negli esseri viventi, così come per conoscere la materia non si può fare a meno di studiare l’atomo.
Con l’uso di microscopi sempre più perfezionati, e in particolare del microscopio elettronico, ben presto apparve chiaro che le cellule, pur essendo analoghe sotto molti punti di vista generali, si differenziano per una caratteristica sostanziale: l’assenza, o la presenza, di un nucleo (karion) distinto e riconoscibile.
Vengono perciò chiamate cellule procariote quelle fornite di membrana e citoplasma, ma sprovviste di nucleo, mentre solo le cellule eucariote presentano tutte e tre le parti fondamentali. Gli organismi unicellulari costituiti da cellule procariote vengono detti Procarioti (ne sono un tipico esempio i batteri) mentre gli organismi unipluricellulari, vegetali o animali, con le cellule eucarioti, vengono dette Eucariote.
Le tre parti fondamentali che costituiscono la cellula eucariote (membrana, citoplasma e nucleo) hanno le seguenti caratteristiche:
 la membrana è un involucro fluido, in cui la cellula stessa è contenuta, che la separa dalle altre cellule o dall’ambiente circostante, regolando anche l’ingresso e l’uscita di materiali;
 il citoplasma è una sostanza gelatinosa, ricca di acqua, sali minerali e sostanze organiche, nella quale si compie gran parte delle funzioni cellulari. Queste funzioni, nelle cellule meglio organizzate ed evolute, sono affidate a organuli;
 il nucleo è la struttura, più o meno sferica, racchiusa da un involucro poroso detto membrana nucleare. All’interno del nucleo si trovano il DNA, nel quale sono immagazzinate tutte le informazioni necessarie per la regolazione delle attività cellulari e per la determinazione delle caratteristiche di ogni singola cellula, e le proteine, solitamente presenti in coppie, in un numero variabile e caratteristico di ciascuna specie.


4 Particolari tipi di cellule: (a) cellule di lieviti (funghi) con cicatrici di gemmazione; (b) cellule stomatiche delle piante superiori; (c) cellula uovo e spermatozoi di animali superiori.




Capsula - È presente, in alcune specie, uno strato mucogelatinoso (proteine e polisaccaridi) per lo più molto sottile, ma in alcuni casi, come nello pneumococco o nel carbonchio, di una certa consistenza.

Membrana citoplasmatica - È la porzione che avvolge il citoplasma; svolge la funzione di permeabilità selettiva per le sostanze che escono ed entrano. È sede degli enzimi respiratori e svolge un ruolo fondamentale nel processo di divisione cellulare.

Citoplasma - È la parte fondamentale della cellula procariote; è un sistema colloidale di aspetto omogeneo, costituito da proteine e soprattutto da RNA, raccolti in granuli, detti ribosomi, dove avviene la sintesi proteica.

Parete cellulare - Circonda la cellula e ha funzione di protezione. È una struttura molto sottile, rigida, ma anche elastica; è costituita da un mucocomplesso, soprattutto amminoacidi, che formano uno strato più o meno spesso. La struttura biochimica della parete è responsabile della diversa colorazione che i batteri assumono dopo trattamento con il colorante di Gram. La diversa risposta è dovuta ai peptidoglicani che costituiscono per metà o quasi completamente (4090%) la parete delle cellule che restano colorate e solo il 510% delle altre, dove la parete è formata soprattutto da lipopolisaccaridi.

Sostanza nucleare - È un ammasso tenue e compatto di un filamento di DNA privo di membrana di rivestimento. Il cromosoma batterico contiene tutti i geni necessari alla crescita e alla riproduzione della cellula, ma in quasi tutte le cellule, sono state osservate altre molecole di DNA, dette plasmidi, che contengono circa 30 geni.

Cromosoma batterico - È un unico filamento che può raggiungere, quando è disteso, fino a 10001500 millimicron e, poiché la cellula non supera i 23 millimicron, il DNA batterico viene riavvolto più volte su se stesso e compattato da RNA specifici.

Ciglia - Di natura proteica, sono l'organo di locomozione. In alcuni batteri si trovano i pili, strutture più corte delle ciglia che svolgono un'importante funzione nel processo di riproduzione batterica.



Lisosomi - Sono sede dei processi catabolici. Si formano su vescicole generatesi sulla membrana piasmatica e contenenti enzimi idrolitici od ossidativi; partecipano alla digestione intracellulare di patogeni e parassiti (fagolisosomi), alla digestione di componenti della cellula, durante i processi di pulizia da molecole od organuli invecchiati (autofagolisosomi).

Parete cellulare - È presente nelle cellule vegetali e fungine, cui dà rigidità e forma. Nelle piante è costituita prevalentemente da cellulosa, nei funghi da chitina.

Apparato del Golgi - Localizzato in prossimità del nucleo, è costituito da “cisterne” appiattite e racchiuse da membrana (pile di Golgi), che nei vegetali prendono il nome di dittiosomi. Alle pile di Golgi sono associate piccole vescicole, rivolte di fronte al reticolo endoplasmico. Ogni pila di Golgi possiede due facce: una CIS di ingresso, direttamente associata al reticolo endoplasmico, e una TRANS di uscita, costituita da un reticolo tubolare. La funzione dell'apparato è di trasporto di proteine, lipidi e macromolecole, che penetrano nella faccia CIS dal reticolo endoplasmico e attraverso le vescicole vengono smistate nelle varie destinazioni, uscendo dalla faccia TRANS.

Membrana cellulare e/o membrana piasmatica - È costituita da un doppio strato fosfolipidico, in cui sono presenti proteine di membrana o TRANS.

Citoplasma o citosol - Ha consistenza di sol se contiene più del 50% di acqua, o di gel se ne contiene meno; è organizzato secondo una struttura proteica a reticolo che collega gli altri comparti tra di loro e con il nucleo. Il citoplasma è in continuo movimento e trascina i vari elementi cellulari permettendo un adeguamento dell'organizzazione interna della cellula alle condizioni esterne.

Mitocondri - Sono organuli costituiti da un sistema di doppie membrane circonvolute che delimitano una matrice, uno spazio intermembranale e il lato interno/esterno della membrana mitocondriale.

Perossisomi- Sono vescicole delimitate da membrane contenenti enzimi ossidativi, che liberano nel corso della loro azione perossido di idrogeno (H202), distruggendo così molecole pericolose.
I perossisomi sono molto importanti nei vegetali perché responsabili del processo di fotorespirazione fogliare (nelle piante C3)

Ribosomi - Sono costituiti da due subunità funzionali che quando aderiscono ad un filamento di mRNA permettono la sintesi proteica. I ribosomi liberi nel citoplasma svolgono la sintesi delle proteine interne della cellula, quelli associati al reticolo endoplasmatico producono proteine che sono spinte esternamente.

Nucleo - Nelle cellule mature si trova aderente alla parete cellulare. È rivestito da una doppia membrana interrotta da aperture (pori nucleari) in connessione con l'esterno attraverso i filamenti del reticolo endoplasmatico. È costituito da materia granulare, detta cromatina, immersa in una matrice entro cui si osserva un corpuscolo tondeggiante e scuro, detto nucleolo.

Reticolo endoplasmatico - È costituito da un sistema di singole membrane. È formato da canalicoli (lume del reticolo endoplasmatico) che occupano il 10% del volume cellulare totale ed è in comunicazione con il nucleo e con l'apparato di Golgi. Il reticolo endoplasmatico ruvido o rugoso presenta, aderenti alla superficie della membrana dal lato citoplasmatico, i ribosomi, mentre il reticolo endoplasmatico liscio ne è privo. Nel primo avviene la sintesi proteica, nel secondo quella degli acidi grassi.

BIOLOGIA APPLICATA E BIOTECNOLOGIE AGRARIE
BIOLOGIA APPLICATA E BIOTECNOLOGIE AGRARIE
GENETICA, TRASFORMAZIONI, AGROAMBIENTE