BIOLOGIA APPLICATA E BIOTECNOLOGIE AGRARIE

I virus vegetali o fitovirus

L’infezione inizia quando le particelle virali vengono introdotte nelle cellule recettive.
Si è sottolineato che i fitovirus non sono in grado di superare da soli la barriera dei tessuti di rivestimento delle piante e neppure di penetrare attivamente nelle cellule qualora il virus non sia già presente nella pianta stessa per trasmissione verticale, dovuta cioè a seme o altro materiale di propagazione infetto; negli altri casi il processo patogenetico si avvia solo in presenza di un qualche evento che comporti l’introduzione del virus nell’ospite o per trasmissione meccanica (ferite e/o contatto con materiale infetto come le forbici per la potatura), ma soprattutto, come vedremo, grazie alla presenza di vettori biotici, fra i quali i maggiori responsabili sono gli insetti.

Patogenesi e danni

Al di fuori dell’ospite, o del vettore, i virus dei vegetali hanno scarsissima o nulla capacità di sopravvivenza; tuttavia, avvenuta l’inoculazione, il virus si insedia stabilmente e comincia a replicarsi e diffondersi.
La diffusione all’interno della pianta, e con ciò la progressione della malattia, può procedere o attraverso le cellule adiacenti il sito di inoculo iniziale, e si ha in tal caso l’infezione localizzata, oppure in tutta la pianta attraverso i sistemi di conduzione, e allora si ha l’infezione sistemica.
I fitovirus si muovono di cellula in cellula attraverso i plasmodesmi, particolari strutture di connessione proprie dei tessuti vegetali, oppure tramite la formazione di strutture tubulari di connessione.
Se raggiungono i tessuti conduttori, essenzialmente quelli fioematici, le singole particelle virali possono essere trasportate a distanza nei vari organi della pianta e poi dal floema passano, ad esempio, in una foglia originando nuovi cicli infettivi (infezione secondaria).
In certi casi i virus sono inoculati direttamente nei vasi fioematici.
La velocità di diffusione dei fitovirus è assai bassa quando migrano per contiguità intercellulare, mentre è misurabile in cm/ora quando sono trasportati con la corrente linfatica.
L’infezione da fitovirus provoca nella pianta alterazioni fisiologiche e metaboliche a cui solitamente si correlano le espressioni sintomatiche macroscopiche.
Così la distruzione dei pigmenti clorofilliani dà luogo a maculature, screziature, giallumi, anche se disturbi all’attività fotosintetica, relativi sia alla fase luminosa sia a quella oscura, non si evidenziano necessariamente con sintomi visibili. Possono essere interessati anche i processi respiratori, che di solito (ma non sempre) tendono a incrementare di intensità, almeno in alcune fasi della patogenesi infettiva. La replicazione del virus, che avviene a spese dei metaboliti cellulari, provoca evidentemente interferenze negative sul metabolismo degli acidi nucleici e di quello delle proteine, nonché anomalie nel biochimismo di carboidrati, acidi organici, composti fendici, fosforo e altre sostanze implicate in varie attività funzionali come la crescita, con l’effetto di produrre una vasta gamma di sintomatologie collegate allo sviluppo della pianta (ad esempio nanismo, getti o foglie soprannumerarie, fasciazioni, laciniature, arricciamenti, escrescenze fogliari crestiformi.


Mosaico fogliare su zucchino da OuMV (Ourmia melon virus).


Omeoplasie crestiformi di origine virale su vite.

Risposte della pianta all’infezione

Le piante possiedono proprie difese contro gli agenti patogeni, fìtovirus compresi. In virologia vegetale vengono prese in considerazione anche le difese di tipo meccanico come le barriere istologiche (strati cutinici e suberosici, peluria), anche se, come già evidenziato, l’inoculazione del virus avviene solitamente tramite lesioni delle superfìci dell’ospite oppure con la mediazione di vettori (insetti, nematodi, ecc.) che lo introducono direttamente nei tessuti vegetali: tali barriere meccaniche possono anche produrre l’effetto di ostacolare l’azione degli insetti vettori.
L’ingresso di fìtovirus dà avvio a un processo il cui sviluppo ed esito finale sono determinati da diversi elementi dipendenti, ad esempio, dallo specifico binomio virus/ospite e da condizioni ambientali o interne all’ospite. Quando l’infezione rimane localizzata (ossia le particelle virali, dopo una prima fase di intensa replicazione nel sito di ingresso, non si diffondono ulteriormente), si manifesta con un danno necrotico circoscritto e tale localizzazione è nota come reazione di ipersensibilità; invece in caso di sistemizzazione, ossia quando il virus si moltiplica espandendosi progressivamente di cellula in cellula ed eventualmente raggiunge i tessuti conduttori, viene distribuito ai vari organi dell’ospite generando nuovi siti di infezione.
La resistenza è detta attiva quando viene impedita l’inoculazione del virus, ma principalmente quando l’ingresso del patogeno scatena una reazione di tipo biochimico di cui la reazione di ipersensibilità è una delle più efficaci; si parla di resistenza passiva, invece, quando il virus non trova nella pianta particolari fattori coadiuvanti (helper host factors).
Relativamente alla tipologia, la resistenza può essere definita:
 immunità;
 resistenza costitutiva;
 resistenza acquisita.
L’immunità è l’assenza di risposta patologica della pianta: ovvero quest’ultima non è un ospite per un dato virus (nonhostresistancé). L’immunità può essere dovuta all’assenza nell’ospite di quei fattori di cui la particella virale ha bisogno per potersi replicare e/o diffondere con successo oppure a un ambiente citoplasmatico sfavorevole al virus (valori di pH, presenza di sostanze antagoniste). In altri termini nell’immunità non c’è interazione tra definite specie virali e determinate piante (ad esempio le gimnosperme raramente si ammalano di virosi); potrebbe essere considerata concettualmente una forma estrema di resistenza.
La resistenza costitutiva è interpretata su basi genetiche e pertanto è ereditabile.
Si manifesta, ad esempio, con la presenza, nell’ambito di una specie vegetale suscettibile, di cultivar (o specie affini) viceversa resistenti; si trasmette alla discendenza come carattere dominante. I meccanismi attraverso cui si realizza possono essere molteplici: nei confronti del vettore, nei confronti della diffusione intercellulare o sistemica del virus, come reazione di ipersensibilità.
La resistenza acquisita si ha quando una pianta, per effetto di un’esposizione a un agente infettivo, a una sostanza chimica o ad altro fattore, acquisisce la capacità di opporsi a una infezione virale compatibile.
Un tipo di resistenza acquisita è la protezione incrociata o preimmunità (cross-protection). essa si concretizza allorché una pianta, inoculata con un ceppo virale (ceppo protettore), mostra successivamente resistenza verso altri ceppi dello stesso virus. La protezione incrociata si può verificare sia quando il virus è inoculato artificialmente sia quando è introdotto da un vettore naturale.
Si tratta di un fenomeno speciespecifico, cioè strettamente vincolato a un dato binomio ceppo di virus/pianta ospite: in altri termini, un determinato isolato virale può essere un efficace protettore per una pianta coltivata suscettibile a quella virosi, mentre se inoculato su un’altra specie di ospite ugualmente suscettibile alla stessa malattia, può non indurre apprezzabili effetti.
Benché il fenomeno appaia similare a quello delle vaccinazioni degli animali, si tratta di un’analogia solo esteriore in quanto la pianta non possiede un sistema immunitario proprio; tuttavia, per alcuni aspetti e implicazioni si può stabilire un qualche parallelismo sull’impiego di questa forma di resistenza a fini profilattici. I meccanismi attraverso cui la protezione incrociata si realizza non sono ancora definitivamente chiariti e oggi si propende a metterli in relazione con il fenomeno del silenziamento genico.

Trasmissione e diffusione dell’infezione

I virus sono trasmessi da una pianta infetta a una sana in diversi modi, la cui conoscenza è importante sia sotto il profilo epidemiologico sia sotto quello strettamente fìtoiatrico, in quanto allo stato attuale le strategie di lotta contro le virosi sono essenzialmente di tipo preventivo, tendenti appunto a impedire la trasmissione.
In via generale si parla di trasmissione verticale quando il virus si propaga con la progenie della pianta infetta, tramite seme, bulbi, talee o altro materiale di propagazione; il concetto è esteso anche nel caso in cui una pianta sana sia impollinata con polline infetto e con la fecondazione il virus passi neU’embrione.
La trasmissione orizzontale si realizza quando i fitovirus, provenienti da una pianta ammalata, vengono introdotti in una pianta sana (è considerata orizzontale anche la trasmissione mediante polline nel caso in cui esso funga semplicemente da mezzo di trasporto fìsico delle particelle virali che poi vadano ad infettare cellule non riproduttive della nuova pianta penetrando, ad esempio, attraverso microlesioni).
Rispetto alla modalità, si distinguono i seguenti casi di trasmissione: per seme, per polline, da materiale di propagazione vegetativo, per contatto, per vettore. La trasmissione per seme è relativamente poco diffusa, ma è importante in alcune virosi. Sotto il profilo epidemiologico può comportare rischi tutt’altro che trascurabili considerando che da un seme infetto si genera una pianta infetta, che può diventare la fonte di cicli di infezione successivi, veicolati ad esempio da vettori animali, sulle piante di una intera coltivazione.
Questa modalità, quindi, rappresenta una strategia di sopravvivenza del virus da un ciclo colturale all’altro della sua pianta ospite. Il virus può essere localizzato nelhembrione oppure su altre parti del seme come il tegumento e, in tale caso, essendo piuttosto resistente, infetterà la plantula solo se accidentalmente si produrranno microlesioni durante la germinazione. I virus, quando sono trasmissibili per seme, lo sono anche per via meccanica e hanno la caratteristica di indurre nelle piante infettate in origine sintomi macroscopici, come maculature e mosaici, mentre in quelle nate da seme infetto non si presentano solitamente segni evidenti della virosi.
La trasmissione orizzontale per polline è stata osservata in pochi virus e in alcuni casi è collegata all’attività di insetti che si imbrattano con il polline virosato e lo trasferiscono visitando altre piante.
La trasmissione per propagazione vegetativa che avviene attraverso un organo della pianta (bulbi, tuberi, rizomi) o una sua parte (talee, margotte, gemme), è possibile per la generalità dei virus. Quest’ultima circostanza è sfruttata anche a fini diagnostici, tramite innesti su piante indicatrici.
La trasmissione per contatto è piuttosto rara in natura, attuandosi in pratica per sfregamento, ad esempio tra le foglie di una pianta ammalata e quelle vicine di una sana: in tal modo si producono microferite attraverso cui il succo della pianta infetta viene a contatto con parti esposte di quella sana. Più spesso è l’uomo che trasferisce il virus meccanicamente con le operazioni colturali e gli attrezzi di lavoro. La modalità di trasmissione per contatto è sfruttata a scopi diagnostici su piante indicatrici (trasmissione per succo).
La trasmissione per vettore è indubbiamente quella di maggiore interesse anche sotto il profilo scientifico. Infatti il vettore non è semplicemente un veicolo inerte, come un attrezzo da lavoro, ma un organismo vivente che stabilisce un rapporto biologico, anche complesso, o quantomeno legato a qualche aspetto della sua attività funzionale. Gli organismi vettori appartengono a svariati gruppi tassonomici: Artropodi, Nematodi, Protozoi, Funghi.


Schema illustrativo di cosa avviene all'interno di un afide nella trasmissione di un virus con modalità di tipo persistente. Gli stiletti boccali dell’insetto sono perfettamente in grado di perforare cuticola ed epidermide degli organi verdi e giungere nei vasi fioematici, dove scorre la linfa contenente gli elaborati. Con la puntura di nutrizione il virus viene ingerito nell’apparato intestinale, poi passa nel sistema di circolazione sanguigna degli insetti (emocele) e, attraverso questo liquido, raggiunge le ghiandole salivari da dove è iniettato con nuove punture.

Modalità di trasmissione per vettore

Le nozioni da tenere in considerazione, in ordine a questa forma di trasmissione, sono:
- fasi temporali;
- efficienza;
- specificità;
- tipologia.
Le fasi temporali sono così identificabili:
- periodo di acquisizione, dato dall’intervallo di tempo necessario affinché il vettore acquisisca il virus (ad esempio nel caso di un insetto con apparato boccale pungentesucchiante, può corrispondere a quello breve delle punture di assaggio o a quello più lungo delle punture di nutrizione);
- periodo di latenza, dato dall’intervallo di tempo necessario affinché il vettore diventi infet
tante, periodo che può variare da zero (ossia non esiste) a qualche giorno;
-  periodo di ritenzione, dato dall’intervallo di tempo in cui il vettore rimane infettante;
-  periodo di inoculazione, dato dall’intervallo di tempo necessario al vettore per inoculare il virus nella pianta.
L'efficienza esprime l’attitudine di un dato vettore a trasmettere un determinato virus.
La specificità esprime il grado di interazione e, di conseguenza, di esclusività del rapporto virus/vettore, grado che può sia riguardare vettori afferenti a un gruppo tassonomico (ad esempio, un virus che viene trasmesso da più di una specie di vettori, ma appartenenti allo stesso livello gerarchico di taxa) sia rimanere più strettamente circoscritto a una o pochissime specie affini. Inoltre la specificità è riferibile anche alla modalità di trasmissione (ad esempio, i virus di un dato genere sono trasmessi di regola con le stesse modalità).
Sintetizzato il quadro complessivo della trasmissione, è opportuno soffermarsi sugli aspetti della trasmissione per vettore biotico. Si distinguono le seguenti tipologie: nonpersistente, semipersistente, persistente (a sua volta suddivisa in propagativa e circolativa).
La trasmissione non-persistente si realizza unicamente con gli insetti del gruppo degli afidi (provvisti di apparato boccale pungentesucchiante), i quali trattengono sugli stiletti boccali le particelle virali che si denaturano in breve tempo se l’afide non punge un tessuto sano inoculando il virus.
Nella trasmissione semipersistente il periodo di ritenzione è di pochi giorni. In questa modalità le particelle virali si localizzano tipicamente sulla superfìcie di rivestimento del tratto iniziale del canale digerente dell’insetto vettore: indipendentemente dalla capacità di sopravvivenza del virus, questo viene eliminato con le mute dell’insetto che coinvolgono anche i primi tratti dell’epitelio di rivestimento dell’apparato digerente.
La trasmissione persistente ha un periodo di ritenzione lungo anche quanto l’intera vita del vettore. I vinoni in questo caso non si limitano a rimanere sulla superfìcie esterna o comunicante con l’esterno del vettore, ma passano nell’interno del suo corpo fino ad arrivare alle ghiandole salivari e di lì sono inoculati con le punture. Nell’ambito della trasmissione persistente si distinguono i virus propagativi, che si replicano nel corpo del vettore, e i virus circolativi, che si limitano a circolare senza moltiplicarsi. Nella modalità di trasmissione persistente la specificità tra virus e vettore è molto alta: il fatto si spiega con l’elevato grado di interazione che necessariamente si deve stabilire tra le due entità, leggibile anche alla luce di strategie evolutive. Le interazioni si verificano, ad esempio, a livello intestinale dove l’assorbimento del vinone è regolato da specifici recettori o mediato da proteine del capside del virus; oppure sono espresse dalla presenza di sostanze idonee a proteggere le particelle virali dalla degradazione enzimatica (in un caso si è dimostrato che tali sostanze sono prodotte da un batterio vivente in endosimbiosi nel corpo dell’insetto). Nella trasmissione persistente propagativa si possono verificare casi in cui i fitovirus, oltre a riprodursi all’interno del vettore, passano anche nella sua progenie. A titolo esemplificativo, nell’ambito della trasmissione persistente descriviamo brevemente quella del TSWV (Tornato spotted wilt virus), agente di malattia su molte specie vegetali, attuata principalmente dal tripide Frankliniella occidentalis.
La femmina di questo insetto ovidepone infliggendo l’ovodepositore appena sotto l’epidermide fogliare; di conseguenza le forme giovanili (neanidi) che sgusciano iniziano ad alimentarsi pungendo e aspirando i succhi cellulari, acquisendo in tal modo le particelle del TSWV eventualmente presenti nei tessuti della pianta.
Durante la fase di neanide, questo tripide presenta una particolare disposizione anatomica dei suoi organi interni, tale che le ghiandole salivari sono unite a un tratto dell’intestino: attraverso tale connessione il virus, che tra l’altro è in grado di replicarsi nelle cellule epiteliali dell’intestino, passa nelle ghiandole della saliva. Con lo sviluppo dell’insetto la connessione si interrompe, ma il virus rimane nelle ghiandole salivari. Per effetto di mute le forme giovanili passano dallo stadio neanide I a quello neanide II e, successivamente, a quelli di preninfa e ninfa (fasi in cui vengono abbozzate le ali, ma l’insetto non si nutre) e, infine, a quello di adulto alato in grado di trasferirsi su altre piante propagando l’infezione.






Neanide (a = 40x) e adulto (b = 20x) di Frankliniella occidentalis. (c) Raffigurazione del ciclo biologico di F. occidentalis in rapporto alla trasmissione dell’infezione. Dall’uovo si sviluppa la forma giovanile, neanide, che attraversa due stadi di crescita separati da mute (neanide di I e II età); le neanidi si nutrono attivamente, perciò durante questi stadi l’insetto è in grado di acquisire il virus. Seguono gli stadi di preninfa e ninfa in cui si formano gli abbozzi alari, ma cessa in pratica l’attività trofica: dunque in questo stadio l’insetto non acquisisce né trasmette virus. Infine la metamorfosi si completa e compare l’adulto alato, in grado di spostarsi e diffondere l’infezione su altre parti della stessa pianta o di trasmetterla su altre piante.

Metodi diagnostici

Per ciò che concerne la diagnostica delle malattie da virus e virussimili, è bene ricordare che non sempre essi producono sintomi osservabili (e stato di sofferenza nella pianta) dai quali partire per imbastire un ragionamento diagnostico, in quanto l’infezione può rimanere allo stato latente.
Tuttavia, quando si presume la presenza di un virus e si rende necessario, ad esempio per motivi epidemiologici, verificare la consistenza del sospetto, si deve necessariamente ricorrere a metodiche di laboratorio, atte in ogni caso a rilevare e identificare (e a confermare se opportuno) il fìtovirus.
Oggi la diagnosi delle virosi segue criteri che, più esattamente, sono definiti metodi di rilevamento. In alcuni casi i virus provocano caratteristiche alterazioni, visibili in microscopia, entro la cellula infetta.


Sezione di tessuto vegetale infettato da un Potyvirus, in cui sono ben evidenti le caratteristiche formazioni a girandole dette pinwheels (a seconda della loro giacitura rispetto al taglio si presentano piatte di fronte oppure con diverse angolazioni). La microfotografia al microscopio elettronico permette inoltre di rendere visibili anche le particelle virali, che sono i sottili bastoncini sparsi un po’ ovunque. La barra di riferimento misura un micrometro (cortesia V. Masenga, Istituto Virologia Vegetale – CNR).

Piante indicatrici
La diagnosi mediante l’utilizzo di piante indicatrici è stata storicamente importante per gli agenti di malattie virali e virussimili e ancora oggi trova impiego perché garantisce alti margini di affidabilità, è economica, è praticabile anche quando non si disponga di laboratori particolarmente attrezzati e infine non richiede competenze specialistiche.
Questa metodologia consiste nel trasferire il virus, mediante inoculazione artificiale, dalla pianta presunta infetta a una sana di cui si conosca la suscettibilità a quel virus e che all’infezione risponda con una sintomatologia esteriore ben visibile e caratteristica.
Quali indicatori biologici si scelgono piante che si caratterizzano per rapida crescita e semplice coltivazione.
Dal momento che un buon numero di virus è trasmissibile per contatto, in via generale l’inoculazione viene praticata mediante semplice strofinamento di foglie della pianta indicatrice con succo della pianta infetta.
Il succo si ottiene per triturazione di tessuti ammalati in soluzione tampone, mentre l’area della pianta indicatrice su cui esso sarà strofinato viene previamente cosparsa con polvere abrasiva, in modo da provocare microferite attraverso cui i virus penetreranno.

Detection methods: rilevamento e identificazione
Il significato di questa procedura diagnostica è reso in italiano con i termini “rilevamento" e “identificazione’’. Lo scopo è accertare la presenza del virus nei campioni vegetali e identificarne contestualmente la specie.
Tali metodi si basano su diverse tecniche, che possono essere di tipo sierologico o molecolare, entrambe analoghe, anzi derivate, da quelle in uso in campo medico.
La diagnosi sierologica, di cui esistono numerose varianti, sfrutta la reazione antigeneanticorpo. Poiché le piante non hanno un sistema immunologico, gli anticorpi vengono ricavati da cavie animali previamente inoculate con una data specie di fitovirus: l’animale produrrà, nei confronti del virus specifici, anticorpi che vengono prelevati dal suo siero per allestire i reagenti di laboratorio.
Questo antisiero viene fatto reagire con succo estratto dalla pianta da diagnosticare su un idoneo substrato: l’avvenuta reazione è resa visibile grazie a sostanze che, per effetto di tale reazione, agiscono sul substrato modificandone il colore (questa tecnica è anche quantitativa, poiché l’intensità del colore è proporzionale alla quantità di particelle virali presenti).
Da quanto detto si tratta di tecniche che non servono genericamente a individuare la presenza di virus, ma ogni antisiero è specifico per un determinato fitovirus; quindi, nella pratica (non potendosi evidentemente effettuare tutti gli incroci possibili, se non altro per ragioni economiche), occorre che ci sia preventivamente una ipotesi diagnostica ottenuta mediante esperienza e osservazione dei sintomi visivi.
La diagnosi molecolare, anch’essa attualmente sviluppata in diverse varianti, sfrutta invece quelle tecniche di laboratorio che, partendo da una infinitesima quantità di acido nucleico (DNA, RNA) dell’organismo da identificare, lo amplificano, ossia lo replicano artificialmente fino a ottenerne una quantità che può essere rilevata con opportuni accorgimenti e sistemi.
Moderne tecniche diagnostiche
I moderni laboratori di virologia vegetale sono attrezzati per effettuare diagnosi con più di una metodica. Accanto al tradizionale saggio mediante inoculazione su piante indicatrici, si lavora con tecniche PRC basate sull’amplificazione del DNA.
Dimostrazione di come viene eseguito il saggio su piante indicatrici.
Si impiegano specie di facile coltivazione di cui è nota la suscettibilità ai virus che si vogliono diagnosticare.


(a) Veduta delle serre dell’Istituto di Virologia Vegetale del CNR, con sede a Torino, dove sono state scattate le foto di questa appendice in occasione delle visite che l’IVV offre anche alle scuole;


(b) in un mortaio si mette una foglia della pianta virosata e poi polvere di carbone per proteggere il virus dalla successiva operazione di spappolamento del tessuto vegetale;


(c) si pesta fino a ottenere una poltiglia;



(d) con un dito o una spatolina si preleva la poltiglia e la si sfrega su una foglia della pianta indicatrice cosparsa di polvere abrasiva (carborundum) ;


(e) in caso di positività la pianta manifesta, nel giro di qualche giorno, una reazione di ipersensibilità con necrosi nei punti in cui il virus è penetrato attraverso le microferite procurate con l’abrasivo.



Due momenti dimostrativi della fase di lettura del test diagnostico basato sulla tecnica PCR. (a) Si inietta in pozzetti su piastra di gel il DNA ottenuto per amplificazione dal frammento di materiale nucleare originario, opportunamente preparato con addensanti e coloranti affinché il campione non “scappi” dal gel e la sua migrazione sia visivamente monitorabile per interrompere la corsa al momento opportuno. (b) L’apparecchio viene chiuso e collegato agli elettrodi: la metodica di separazione in celle elettroforetiche si basa sul fatto che il DNA, avendo numerosi gruppi chimici fosfati, è dotato di carica elettrica negativa per cui, posto in un gel in campo elettrico a corrente continua (la cella elettroforetica della foto), migra dal polo al polo + . Per effetto della matrice porosa del gel i frammenti molecolari più piccoli migrano più velocemente depositandosi molto lontano, così che alla fine si otterrà una serie di bande di ampiezza e disposizione caratteristiche in relazione al DNA testato. La rilevazione delle bande viene fatta trattando il gel con bromuro di etidio, che impregna il DNA ed è fluorescente ai raggi ultravioletti; ciò consente la lettura dei risultati dell’elettroforesi (il gel è esaminato con un transilluminatore a luce UV) e quindi l’elaborazione finale dei dati (il bromuro di etidio è una sostanza mutagena il cui impiego in laboratorio richiede l’adozione di misure di sicurezza per l’operatore; la stessa lastra viene poi bonificata a fine saggio).

Qui considereremo due tecniche sierologiche, quella conosciuta con l’acronimo ELISA (EnzymeLinked ImmunoSorbent Assay) e quella chiamata lateralflow. L’ELISA è un saggio basato su una reazione antigene-anticorpo, la quale viene rivelata grazie a un enzima coniugato con l’anticorpo in grado di produrre, in caso di positività, un viraggio di colore del substrato con cui si opera. Poiché l’intensità del colore è proporzionale alla concentrazione dell’antigene presente, con questa metodica si ottiene anche una diagnosi di tipo quantitativo.
Per la preparazione di anticorpi ci si serve di animali da laboratorio in cui il frtovirus è inoculato in modo da indurre una reazione del sistema immunologico dell’animale. Il rivestimento capsidico si comporta infatti da antigene, nei confronti del quale i linfociti dell’animale producono specifici anticorpi che si diffondono nel sangue, più esattamente nella frazione liquida (il siero).
Un siero ricavato in questo modo è detto antisiero rispetto alla specie virale di partenza: esso, anche al di fuori del corpo dell’animale che lo ha prodotto, è capace di dar luogo alla reazione antigeneanticorpo senza perdere la specificità. Gli anticorpi, dal punto di vista chimico, sono proteine chiamate immunoglobuline di cui esistono varie tipologie identificate con una sigla: quelle impiegate nei test sierologici sono le IgG. La metodica prevede alcune varianti raggruppate in due tipologie principali: ELISA diretta ed ELISA indiretta.
Nel metodo diretto si sensibilizza la piastra con un anticorpo che intrappola le particelle virali successivamente introdotte con il campione da testare; quindi viene aggiunto l’anticorpo coniugato che si lega a “sandwich e infine il substrato su cui agisce l’enzima e che lo fa virare di colore (il tutto viene regolato da tempistiche precise e lavaggi.
Questo metodo offre il vantaggio della semplicità esecutiva a scapito, però, di qualche imprecisione per l’interferenza provocata dall’enzima coniugato.


(a) Rappresentazione dell’ELISA diretta (DASELISA = Double Antibody SandwichELISA). L’enzima coniugato è una fosfatasi alcalina che fa virare al giallo il substrato successivamente aggiunto. Nello schema sono omessi i diversi lavaggi eseguiti dopo ciascun passaggio, con i quali si provvede anche a eliminare l’anticorpo coniugato (qualora non fosse stato catturato dalle particelle virali), in modo che il viraggio non abbia luogo in assenza dell’antigene virale (da Belli).


(b) Esiti di un test (presso Istituto Virologia Vegetale – CNR).
Nei metodi indiretti (ad esempio TAS-ELISA = Triple Antibody SandwichELISA), più laboriosi ma con migliore reattività, sul virus catturato dal primo anticorpo è applicato un secondo anticorpo specifico preparato in animale diverso per evitare interferenze (il primo in pollo, il secondo in coniglio in quanto le IgG di uccelli e mammiferi non reagiscono tra loro). Segue un ulteriore passaggio con anticorpo antiIgG, specifico per l’anticorpo di coniglio e coniugato con la proteina enzimatica (esso proviene da un terzo animale, la capra, ed è detto coniugato universale perché non specifico per il virus). Il lateralflow è un test diagnostico rapido di tipo immunocromatografìco.
Il dispositivo è un supporto cromatografico nitrocellulosico su cui sono stati fatti seccare in bande successive da sinistra a destra:
- una prima linea di anticorpi antivirus, specifici per un determinato virus, coniugati con tintura rossa di oro colloidale, preparati in coniglio;
-  una seconda linea con gli stessi anticorpi;
-  una terza linea formata invece da anticorpi anti-IgG di coniglio; la striscia si chiude con materiale assorbente: questo serve a facilitare lo scorrimento del campione da saggiare, sotto forma di succo in soluzione, una goccia del quale viene infatti posta su un cuscinetto all’inizio della striscia.


Il tutto può essere allestito con una copertura, provvista di finestre per protezione, che offre una lettura dei risultati più comoda.
La soluzione liquida contenente il campione reidrata il reattivo della prima linea (anticorpi coniugati con oro colloidale che vanno in soluzione) e il tutto scorre per capillarità verso il materiale assorbente.
Se nel campione non sono presenti particelle virali, il liquido passerà indenne attraverso la linea degli anticorpi virali, ma sarà arrestato dalla linea degli anticorpi anti-IgG: la conseguente precipitazione dell’oro colloidale si renderà visibile con la formazione di una banda di colore rosso.
Se invece il virus è presente, esso reagirà con la linea dei suoi specifici anticorpi e dunque sarà intrappolato con la parte di oro colloidale con cui si è coniugato (anche in questo caso la reazione viene rivelata dal precipitato rosso); la parte in eccesso contenente l’oro colloidale continuerà a migrare fino alla seconda linea di anticorpi anti-IgG, con ulteriore formazione di una seconda banda rossa.
Dunque la positività al virus saggiato si manifesta con la comparsa di una doppia banda, mentre la negatività con la comparsa di una sola.
La figura sotto illustra come viene eseguito il saggio. Una foglia del campione è posta in una bustina di plastica, già predisposta e contenente un foglietto di materiale adatto a triturare; poi si aggiunge una soluzione tampone contenente un detergente nonionico e un antiossidante e si passa sopra con un qualsiasi oggetto, a mo’ di pestello, in modo da spappolare i tessuti (a) e far andare il succo vegetale in soluzione.
Si prelevano ora poche gocce che vengono deposte sul cuscinetto iniziale (b) ovvero nella prima finestra se il dispositivo ne è dotato; si attende qualche minuto affinché il liquido scorra e reagisca. In (c) è rappresentato il materiale occorrente e il risultato delle prove (si testava per due tipi di virus su foglia di tabacco, ToMV e TSWV).


Esecuzione del test rapido lateralflow presso l’Istituto di Virologia FgramCNR. (Spiegazione nel testo).

L’intensità della colorazione è proporzionale alla concentrazione di particelle virali e nella dimostrazione il supporto reattivo per il virus TSWV ha dato un esito debolmente positivo.

Strategie di lotta

Terapia e produzione di materiale sano

Le virosi non sono ordinariamente curabili, per lo meno su coltivazioni in pieno campo; tuttavia esistono alcune terapie praticabili in laboratorio e c’è anche la possibilità di realizzare applicazioni pratiche in coltura basate sul fenomeno della protezione incrociata. Le tecniche terapeutiche di laboratorio sono la termoterapia e la coltura in vitro degli apici meri stematici.
La prima sfrutta la differente sensibilità al calore di pianta ospite e fìtovirus. Questi ultimi, infatti, non sopportano temperature relativamente elevate, ma ancora compatibili con la sopravvivenza della pianta infetta.
Quando si debba risanare materiale di propagazione si può impiegare acqua a 50 °C in cui immergere, ad esempio, bulbi o tuberi per 3060 minuti: i semi possono essere trattati a secco con temperature più alte, fino a 85 °C, per non più di un quarto d’ora; le piante in vaso, invece, vengono poste in celle climatiche e mantenute, previa fase di acclimatamento, a temperature di 3040 °C per periodi che possono prolungarsi per parecchie settimane, talvolta variando alternativamente i parametri di illuminazione e temperatura.


(a) Il risanamento di piante virosate può avvenire, in taluni casi, regolando le condizioni delle celle climatiche (nell’immagine quella in dotazione all’Istituto di Virologia Vegetale – CNR Torino)


(b) Gli apici vegetativi di piante risanate, virus esenti, possono essere espiantati per le procedure di micropropagazione.

La coltura degli apici meristematici si basa sulla constatazione che questa porzione di tessuto di regola non è raggiunta o infettata dal virus. La ragione per cui gli apici vegetativi rimangono indenni è attualmente interpretata con argomenti di genetica molecolare.
Il prelievo dei meristemi apicali frequentemente viene fatto precedere da termoterapia: il tessuto espiantato è messo in coltura secondo le usuali tecniche in vitro; la salubrità delle piantine che si originano è rigorosamente controllata e successivamente esse sono impiegate per produrre materiale di propagazione sano coltivato in serre chiuse e poi controllate affinché tale materiale non venga infettato da vettori.

Prevenzione e lotta ai vettori
La lotta alle virosi si fonda essenzialmente su criteri di carattere preventivo che, dal punto di vista fìtoiatrico, afferiscono ai principi di esclusione ed eradicazione.
Per “esclusione"; si intendono tutte quelle pratiche, prevalentemente legislative, supportate dalle moderne tecniche diagnostiche dei test rapidi in campo, finalizzate alla vigilanza sui traffici e sulla certificazione fìtosanitaria dei materiali propagativi messi in commercio, tali da impedire introduzione e diffusione di piante o parti di piante virosate in grado di costituire in loco nuovi serbatoi di infezione.
Per “eradicazione"; si intendono le pratiche, legislative ed agronomiche, volte a eliminare possibili focolai di infezione e si concretizzano con l’estirpazione e la distruzione delle piante infette.
La lotta ai vettori fa parte delle procedure ordinarie per arginare la propagazione dei fitovirus (ovviamente per quelli ritenuti più pericolosi e che, normalmente, sono trasmessi da insetti).
In questi casi è essenziale in primo luogo individuare con sicurezza l’agente che funge da vettore, quindi studiarne la biologia per mettere a punto sistemi di monitoraggio e strategie mirate di intervento.

Verifiche

Domande a risposta aperta
Rispondi in tre righe alle seguenti domande.
1.    Descrivi la struttura di un virus
2.    Cosa sono i prioni?
3.    Descrivi la patogenesi delle virosi.
4.    Come avviene la replicazione del virus?
5.    Come avviene la trasmissione dei fìtovirus?
6.    Come si fa una diagnosi di malattie virali e cosa sono le piante indicatrici?
7.    Come diffonde il virus nella pianta e quali sono i principali sintomi da virosi?
8.    Quali sono le tecniche di profilassi e terapia dei fìtovirus?
9.    A cosa servono le proteine strutturali?
10.   Quali funzioni hanno le proteine genomiche?
11.   Quali funzioni hanno i geni precoci?
12.   Cos’è la reazione di ipersensibilità?
13.   In che cosa consiste la trasmissione semipersistente?
14.   Come avviene la diagnosi per mezzo di piante indicatrici?
15.   Come è fatto il dispositivo impiegato nel lateralflow?
16.   In che cosa consiste la termoterapia?

Scegli la risposta esatta
1.    I virus si riproducono per
- scissione binaria
- gemmazione 
- nessuna di queste
2.    I virus che attaccano le piante non si trovano nei tessuti
- parenchimatici
- i meristematici 
- vascolari
3.    Come si chiama l’involucro che costituisce la struttura esterna del virus?
- cartuccia
- capsula 
- capside
4.    Il test ELISA si esegue per
- individuare una fìsiopatia
- individuare un virus
  - vedere i batteri
5.    I virus sono visibili al microscopio
- stereoscopico
- ottico
- elettronico a trasmissione
6.    Se i virioni sopravvivono nel vettore per un lungo periodo di ritenzione si parla di trasmissione
- semipersistente
- persistente 
- non persistente
7.    La proprietà di un virus che, avendo infettato un ospite, previene o impedisce l’infezione dello stesso ospite da parte di un altro agente patogeno si chiama
- preimmunità
- resistenza acquisita 
- resistenza costitutiva
8.    La trasmissione di un virus da genitori a figli attraverso seme, bulbi, talee è
- orizzontale
- verticale
- indifferente

Rispondi con Vero/Falso
1. I virus sono cellule.........................................V F
2. Alcuni virus hanno una capside...............................V F
3. I virus si muovono autonomamente.............................V F
4. I virus sono formati da un involucro proteico
e da acido nucleico.............................................V F
5. La maggior parte dei virus vegetali presenta DNA.............V F
6. L’acido nucleico virale si localizza generalmente
nel nucleo della cellula ospite.................................V F
7. I retrovirus sono virus a DNA................................V F
8. Il virus HIV è a DNA.........................................V F
9. La termoterapia consiste nel bruciare le parti infette.......V F
10. La coltura meristematica è esente da virus..................V F

BIOLOGIA APPLICATA E BIOTECNOLOGIE AGRARIE
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GENETICA, TRASFORMAZIONI, AGROAMBIENTE