BIOLOGIA APPLICATA E BIOTECNOLOGIE AGRARIE

5 Microrganismi naturali, transgenici e loro applicazioni

Sono state essenzialmente motivazioni economiche (derivate dall’alto costo delle sintesi industriali a far preferire la biosintesi alla sintesi chimica):
-  materia prima meno costosa (polisaccaridi, residui di lavorazione dell’industria alimentare, melassa 0 siero di latte) rispetto a petrolio e suoi derivati;
-  quantità di substrato convertito;
-  durata della sintesi;
-  recupero del prodotto finale.
Delle centomila e più specie microbiche esistenti in natura, solo alcune centinaia sono utili all’uomo e sono da cercare tra lieviti, muffe, batteri.


Sintesi dei principali settori di interesse dei batteri.
Lieviti - Fra gli Ascomiceti: Saccharomyces cerevisiaee uvarum (birra, vino, sakè, panificazione), Kluyveromyces fragilis(alcol da siero di latte), fra i Deuteromiceti: Candida utilis (residui dell’industria della carta), Trichosporon cutaneum (ossida composti tossici come i fenoli ed è quindi utile nei processi di depurazione), PhafSa rhodozyma (sintetizza un carotenoide utile a colorare la carne di trote e salmoni).

Muffe - Idrolizzano l’amido di riso 0 di soia che per fermentazione produrrà il sakè o la soia fermentata. Producono enzimi (amilasi, proteasi, pectinasi), acidi organici (citrico, lattico), antibiotici, caratterizzano formaggi quali roquefort e camembert.

Batteri - Fra gli Eubatteri: Gluconobacter e Acetobacter (ossidano l’alcol etilico ad acido acetico il primo e poi a H„0 e CO,, il secondo), il Clostridium acetobutylicum (zuccheri in acetone, etanolo, isopropanolo e nbutanolo). Batteri lattici omo ed eterofermentanti, Corynebacterìum glutamicum tammico usato come condimento). Fra gli Attinomiceti: Streptomyces (produce antibiotici).

Durante il loro metabolismo aerobico o per fermentazione i microbi producono metaboliti primari (sostanze necessarie al loro stesso sviluppo), metaboliti secondari (antibiotici, tossine), enzimi.


Cellule di Saccharomyces uvarum, lievito presente nelle fermentazioni di vino e birra

I progressi della genetica microbica e le tecniche dell’ingegneria genetica sono stati applicati ai ceppi di interesse industriale e hanno prodotto microrganismi transgenici, il cui metabolismo orientato consente di produrre in grande quantità sostanze utili per l’industria farmaceutica, l’industria agroalimentare e le problematiche ambientali.






Utilizzazione industriale di microrganismi ed enzimi microbici per l’industria agroalimentare (a), farmaceutica (b), per la tutela dell’ambiente (c).

Industria farmaceutica

Si può dire che la storia delle biotecnologie abbia inizio con la realizzazione di prodotti per la salute: negli anni ’40 del secolo scorso, durante la seconda guerra mondiale, era urgente avere disponibilità di farmaci per curare i feriti. Fu così che fu messo a punto il processo di produzione del primo antibiotico.
Da allora, anche con l’uso delle biotecnologie, importanti traguardi sono stati raggiunti ed altri sono ancora in fase di studio nel settore della diagnosi, della terapia e della profilassi.
La diagnostica utilizza gli anticorpi monoclonali di cui si è già parlato, per la diagnosi di epatite B, infarto e di alcuni tumori. In terapia, iniziando con gli antibiotici sono in uso ormoni ed enzimi quali l’insulina, l’ormone della crescita, l’attivatore tissutale del plasminogeno, ottenuti da microrganismi modificati. Nella profilassi, l’impiego di vaccini ricombinanti è il miglior modo per scongiurare infezioni senza incorrere in effetti collaterali.

Antibiotici
Gli antibiotici sono sostanze che, prodotte da batteri, muffe o anche piante hanno le proprietà di uccidere determinati microrganismi. La loro scoperta fu fatta da Alexander Fleming nel 1928 in una coltura di muffa di PeniciMum notatimi e penicillina; fu il nome del primo antibiotico.




Colture batteriche con sviluppo di muffa di Penicillium notatum.

Ad essa seguirono cefalosporina, tetraciclina, eritromicina prodotti dal Cephalosporìum acremonium, Streptomyces erythieus e da altri Attinomiceti. Gli antibiotici in natura sono elaborati dai microrganismi, come prodotti secondari del metabolismo (metaboliti secondari), non sono indispensabili alla loro vita, anzi in una prima fase sono dannosi. L’industria sfrutta questi microrganismi: con mutazioni indotte e selezione ha ottenuto ceppi particolarmente produttivi, capaci di superare velocemente la prima fase in cui i microrganismi sono sensibili ai loro stessi antibiotici, per passare velocemente alla seconda in cui il livello produttivo si alza.

Insulina
L’insulina è un ormone prodotto dal pancreas; chimicamente è una proteina (due catene di 21 e di 30 amminoacidi). Ha la funzione di stimolare il catabolismo del glucosio e di regolare l’utilizzazione degli zuccheri. La sua carenza causa una malattia nota come diabete mellito.
La terapia del diabete è da molti anni attuata con la somministrazione di insulina prodotta da pancreas animale, che differisce da quella umana per un amminoacido. Sembrerebbe una piccola differenza, invece è sufficiente a causare pericolose allergie e, quindi, prima di essere utilizzata, l’insulina animale deve subire vari passaggi di purificazione. L’obiettivo di ottenere insulina simile a quella umana è stato raggiunto con le tecniche dell’ingegneria genetica inserendo il gene d’insulina umano in un batterio che, divenuto ricombinante, viene prodotto su larga scala secondo una tecnica definita di fermentazione. 1 m3 di coltura batterica produce 200 g di insulina che si otteneva da ben 18002000 kg di pancreas animale. Prima di essere commercializzata la proteina viene purificata e analizzata.



Ormone della crescita (GH o somatotropo)
Si tratta di una proteina (una catena di 191 amminoacidi) prodotta dalle cellule del lobo anteriore dell’ipofisi, con la funzione di stimolare la crescita delle ossa e del corpo. La carenza è causa del nanismo ipofisario, la cui unica terapia in passato era la somministrazione di ormone di origine umana.
Somministrare ormone di origine umana comporta molte difficoltà sia nel trovare il materiale sia nella possibilità di trovarlo contaminato da prioni responsabili di quella forma degenerativa nota come sindrome di Creutzfeldt-Jakob.
La tecnica del DNA ricombinante ha risolto questi aspetti.

Attivatore tissutale del plasminogeno
È un enzima, chimicamente una proteina (una catena di 527 amminoacidi). Nell’organismo viene prodotto dai tessuti degli endoteli vasali con il compito di attivare il plasminogeno trasformandolo in plasmina, sostanza capace di rendere solubile la fibrina.
Questa sostanza è il polimero che, trattenendo come una rete le piastrine, forma un trombo. In condizioni normali, in caso di lesione arteriosa l’attivatore si libera e produce plasmina che scioglie il trombo; non così in caso di malattie trombotiche, responsabili di molti decessi nei Paesi industrializzati. L’attivatore tissutale del plasminogeno viene oggi prodotto con le tecniche del DNA ricombinante che hanno consentito l’ampia disponibilità di questa sostanza.



Vaccini
Si è già detto che i vaccini rappresentano una forma di immunizzazione attiva, simile a quella conseguita superando la malattia. I vaccini tradizionali, formulati con microrganismi patogeni uccisi o viventi ma attenuati, sono di alta efficacia ma non privi di effetti collaterali che possono arrivare addirittura all’encefalite postvaccinica o risultare difficoltosi da produrre con caratteristiche costanti. Importante è l’introduzione di vaccini con tecniche ricombinanti.
Il primo ad essere prodotto è stato il vaccino antiepatite B prodotto inserendo il gene S del DNA virale che codifica l’antigene di superfìcie del virus dell’epatite B in un plasmide. Questo lo trasporta nella cellula di lievito che esprimerà la proteina p24, cioè il vaccino. La disponibilità pressoché illimitata del vaccino ha consentito vaccinazioni di massa con la speranza di debellare la malattia. Un’altra importante vaccinazione è la vaccinazione antipertosse, attuata con la tossina estratta dall’agente patogeno della malattia, la Bordetella pertussis, in passato non priva di effetti collaterali.




L’individuazione del gene produttore della tossina antipertosse, l’introduzione in esso di due mutazioni e la sua reinserzione nella Bordetella pertussis ha fatto sì che questa producesse una tossina capace di produrre antigeni ma non tossica.
Il vaccino ricombinante, oggi disponibile, non presenta alcun rischio.
Lo schema riepiloga quanto deriva dal settore microbiologico e biotecnologico a vantaggio della salute umana.


Industria agroalimentare

Il fatto che i prodotti che arrivano sulla nostra tavola derivino semplicemente dal lavoro del contadino è ormai vero solo in parte.
Molti degli alimenti oggi a nostra disposizione sono stati sottoposti a qualche trattamento biotecnologico, la qual cosa ci impone molte domande e interrogativi sui risvolti che tali trattamenti possono avere sulla nostra salute.
Di piante e animali transgenici che consentono di migliorare qualità e quantità dei prodotti vegetali e animali si è già detto; parliamo ora di microrganismi transgenici.
Le biotecnologie tradizionali sono divenute innovative in seguito alla possibilità di intervenire geneticamente sui microrganismi che le inducono.
Il settore coinvolto è l’intera industria di trasformazione e conservazione che oggi utilizza:
- coadiuvanti biotecnologici e additivi per migliorare le caratteristiche organolettiche o di conservabilità degli alimenti;
- biosensori, mezzi di controllo della contaminazione chimica e biologica dei cibi.
Coadiuvanti tecnologici e additivi
Durante la lavorazione dei prodotti alimentari vengono spesso aggiunte sostanze prive di valore nutritivo

Tutti i cibi di derivazione industriale che troviamo sulle nostre tavole e sulle scaffalature alla vendita, sono normalmente coadiuvati o trattati con sostanze, molte delle quali prodotte da microrganismi specificatamente ingegnerizzati allo scopo.

Esse vanno a migliorare le fasi di produzione o a conferire maggiore stabilità all’alimento finito: sono i cosiddetti additivi (acidificanti, aromatizzanti, dolcificanti, enzimi).
Se tali sostanze vengono aggiunte per rispettare un determinato obiettivo tecnologico, si chiamano invece coadiuvanti tecnologici (enzimi). Additivi e coadiuvanti tecnologici vengono utilizzati da tempo nell’industria agroalimentare che li estrae da prodotti naturali o li prepara per sintesi chimica; oggi vengono ottenuti anche da microrganismi selezionati o ingegnerizzati.
Acidificanti - Alcuni ceppi microbici producono metaboliti primari in grande quantità.
L’Aspergillus niger produce acido citrico a partire dalla melassa. Il Lactobacillus delbrueckii produce l’acido lattico utilizzato dall’industria alimentare per acidificare succhi e polpa di frutta, bevande analcoliche, gelati, prodotti dolciari.
Aromatizzanti - Presenti naturalmente negli alimenti, possono essere aggiunti intenzionalmente per esaltarne il gusto.
La vaniglia, usata nell'industria dolciaria, è estratta da una orchidea del Madagascar, ma se ne ottiene una maggior quantità dalla coltura di cellule vegetali. Dal Corynebacterìum glutamicum si ottiene glutammato, di per sé insapore, ma capace di aumentare la sapidità dei cibi. Usato soprattutto dalla cucina orientale, che lo estraeva da un’alga, oggi lo si ottiene attraverso la biotecnologia; viene impiegato per salse, conserve di carne e di pesce, paste ripiene, purè, gnocchi.
Dolcificanti - Sostituiscono saccarosio e glucosio, poiché hanno maggiore potere dolcificante e minore apporto calorico. Nella produzione del pane e nell'industria dolciaria si usano amilasi prodotte da Bacillus amyloliquefaciens per favorire l’idrolisi degli amidi o del maltosio e preparare sciroppi zuccherini. Ci sono poi edulcoranti di natura proteica, come la taumatina; estratti da piante esotiche sono utilizzati per i prodotti di confetteria, per le gomme da masticare e per preparati dietetici.


Bacillus amyloliquefaciens utilizzato per la produzione di amilasi.

Enzimi - Possono essere usati sia come additivi (per intenerire le carni) o come coadiuvanti, ad esempio il caglio aggiunto al latte per produrre formaggio.
A seconda del substrato su cui si sviluppano, gli enzimi si suddividono in proteasi, glucidasi, lipasi.
Proteasi - Sono gli enzimi che degradano le proteine, tra essi il più importante è la rennina: la produzione del formaggio prevede, per la coagulazione del latte, l’impiego di un complesso di enzimi, tra i quali prevale la rennina (chimosina), contenuti nell’abomaso di vitelli lattanti.


Nello stomaco dei lattanti è prodotto l’enzima che favorisce la digestione del latte.

Estratto dalle cellule del pancreas di bovini lattanti, il gene che codifica l’enzima viene inserito nel batterio Escherìchìa coli, che acquisirà la capacità di produrlo in grande quantità come metabolita secondario. La “rennina ricombinante’’ ha le stesse caratteristiche di quella naturale e consente di produrre un formaggio chiamato dagli americani "formaggio vegetale".



Vari tipi di formaggi erborinati: il bleu, il gorgonzola, il roquefort

Proteasi da Aspergillus vengono usate al posto dell’enzima vegetale papaina, estratto dalla papaia, per ammorbidire la carne.
Glucidasi - Degradano i polisaccaridi; molto importanti sono le amilasi per l’idrolisi dell’amido: alfaamilasi, betaamilasi, isoamilasi, glucoamilasi vengono prodotte da diverse specie di Bacillus e Saccharomyces. Le pedinasi da Aspergillus niger intervengono nella chiarificazione di vini e succhi di frutta, la lattasi da Saccharomyces per idrolizzare il lattosio e produrre latte delattosato per coloro che sono intolleranti a questo zucchero. La glucosioisomerasi trasforma l’amido di mais in una miscela di glucosio e fruttosio al 50%, detta sciroppo di glucosio, richiesto daU’industria dolciaria in quanto, a parità di potere dolcificante, è più pratico ed economico del saccarosio.
Lipasi - Degradano i grassi e sono prodotte da ceppi selezionati dei generi Bacillus, AspergillusMucor. Queste sono meno utilizzate rispetto agli enzimi precedenti, vengono impiegate insieme ad essi nel processo di maturazione del formaggio e trasformano una cagliata insapore in un formaggio dalle caratteristiche organolettiche ben definite: Penicillium loquefoiti per il roquefort o il Penicillium glaucum per il gorgonzola.
Sono allo studio nuovi ceppi batterici ingegnerizzati per la produzione di enzimi utili o da usare come coltura di inizio; per indirizzare il processo di caseificazione verso le caratteristiche cercate.
Biosensori
Sono strumenti di analisi costituiti da materiale biologico (cellule batteriche, enzimi, anticorpi) immobilizzati su supporto solido messo a contatto con un sensore che converte il segnale biologico in un segnale elettrico registrabile da uno strumento.


In maniera schematica, il biosensore è costituito da un elettrodo con sensore elettrochimico collegato ad una membrana permeabile cui è fissato l’enzima, l’anticorpo o le cellule batteriche capaci di reagire specificamente con il substrato che si cerca.


In presenza del substrato avverrà la reazione:
Uno dei campi di impiego più interessanti dei biosensori è il controllo di qualità degli alimenti.
Esso è volto alla ricerca di microrganismi (Salmonella), tossine microbiche, residui di fungicidi, insetticidi ed erbicidi nell’acqua o nei cibi.
In questo settore di analisi trovano impiego gli enzimi immobilizzati.
Gli enzimi, che svolgono un ruolo fondamentale nell’industria biotecnologica, sono estratti dai microrganismi che ne producono in gran quantità, ma spesso sono molto costosi.
Il loro impiego può avvenire usando cellule intere o enzimi isolati.
Le cellule intere sono da preferire quando si tratta di far eseguire processi con numerosi passaggi catalizzati da enzimi diversi, altrimenti si preferiscono gli enzimi isolati.
L’uso di enzimi nei processi industriali, se da un lato offre molti vantaggi (risparmio energetico, uso di soluzioni acquose, alta specificità), dall’altro presenta qualche svantaggio: gli enzimi sono instabili, ed essendo solubili in acqua, è diffìcile estrarli dal substrato dopo la reazione e riutilizzarli.


(a) Biosensore; (b) immobilizzazione degli enzimi.

Per far fronte al problema si immobilizzano gli enzimi su supporti solidi come acciaio, vetro, ceramica, carbone, opportunamente attivati per legare saldamente l’enzima, oppure si usano scambiatori di ioni che formano un legame più debole.
Il supporto è permeabile solo ai substrati e ai prodotti di reazione. È così possibile la lavorazione in continuo e un facile recupero dell’enzima alla fine della reazione. Nello schema sono riepilogati gli utilizzi biotecnologici nel settore alimentare.


Schematizzazione dei possibili utilizzi delle biotecnologie nell’industria alimentare.

BIOLOGIA APPLICATA E BIOTECNOLOGIE AGRARIE
BIOLOGIA APPLICATA E BIOTECNOLOGIE AGRARIE
GENETICA, TRASFORMAZIONI, AGROAMBIENTE