BIOLOGIA APPLICATA E BIOTECNOLOGIE AGRARIE

Acidi nucleici e codice genetico

Ogni vivente deve le proprie caratteristiche a un particolare acido che prende il nome di DNAacido desossiribonucleico. Questo acido porta le informazioni necessarie a svolgere due funzioni fondamentali: la replicazione e il differenziamento. Esso consente la vita degli organismi grazie alla codificazione e alla trasmissione dell’informazione genetica che vi è contenuta sotto forma di codice genetico il quale, una volta interpretato, dà origine alle proteine o a RNA funzionali.


5 (a) DNA catena doppia; (b) struttura del nucleotide. Secondo convenzioni internazionali, all’adenina corrisponde il colore verde, alla guanina il blu, alla timina il rosso, alla citosina il giallo.

Il DNA

Il DNA è costituito da due filamenti che nel loro insieme ricordano una cerniera lampo: infatti, come in una cerniera, i filamenti possono restare uniti o separarsi temporaneamente per poi ritornare ad unirsi.
Chimicamente il DNA si può definire un polimero di quattro diversi monomeri detti nucleotidi (base azotata + zucchero pentoso + acido fosforico). L’immagine del DNA, ottenuta per la prima volta trapassando la molecola con i raggi X, rivelò una struttura simile a una scala a chiocciola: due “corrimano di zuccheri (molecole di desossiribosio fosforilato), quattro diversi “gradini (le basi azotate: adenina, guanina, timina, dtosina) a formare una doppia elica. Il legame fra adenina e timina e fra guanina e dtosina è a idrogeno, quello fra una base azotata e il desossiribosio è Nglicosidico, mentre quello fra i vari nucleotidi è realizzato dal gruppo fosfato che si unisce al carbonio in posizione 5’ del desossiribosio di un nucleotide col carbonio in posizione 3’ del desossiribosio del nucleotide successivo.
Per motivi sterici (di ingombro fìsico) la successione delle basi non può essere casuale e si scoprì che Padellina di un’elica poteva legarsi, con legame a idrogeno, solo alla timina dell’altra elica e la guanina alla citosina. A causa di questo vincolo ogni elica è speculare all’altra. Il DNA ha perciò una struttura ad alfaelica, con giri destrorsi e con catene antiparallele orientate in direzioni opposte (antiparallele); quindi un filamento corre in direzione 5’ > 3’, mentre il filamento complementare è orientato in direzione 3’ > 5’.
Tale fenomeno si definisce antiparallelismo dei filamenti.
Per quantificare il DNA, si fa riferimento al numero delle paia di basi (essendo il DNA costituito da due eliche in cui i nucleotidi si affacciano a coppie) e si usano come unità di misura i simboli: bp (base pairs, coppia di basi), kb (kilobasi), Mb (megabasi). Per esempio, un frammento costituito da 1.000.000 di paia di basi, può essere indicato come 1.000.000 bp, 1000 kb, o 1 Mb.
Il DNA può essere paragonato a un archivio nel quale sono conservate tutte le informazioni utili a determinare le caratteristiche di un individuo.

L’RNA

L’RNA (acido ribonucleico) è un acido nucleico il cui principale compito è guidare la sintesi delle proteine a partire dall’informazione contenuta nei geni nel DNA.
L’RNA differisce dal DNA per le dimensioni, per la struttura dei nucleotidi e per il ruolo che svolge nella cellula:
1. la prima differenza riguarda le dimensioni: la molecola dell’RNA è infatti molto più piccola, essendo formata da un filamento unico;
2. la seconda differenza riguarda le basi azotate: nel DNA è presente la timina, che nell’RNA è sostituita dall'uracile, una timina demetilata. Le altre tre basi azotate, guanina, citosina e adenina, sono invece presenti in entrambi gli acidi nucleici;
3. la terza differenza riguarda lo zucchero, che nell’RNA è il ribosio. Questo zucchero contiene un gruppo ossidrilico in posizione 2 che è assente nel desossiribosio del DNA (acido desossiribonucleico).
Questa caratteristica fa sì che l’RNA non risulti idoneo alla conservazione dell’informazione, poiché lo espone a un’idrolisi più rapida.
Vi sono tre tipi di RNA:
RNA messaggero (mRNA) che ha il compito di trasferire nel citoplasma l’informazione. È una molecola lineare di lunghezza variabile che viene degradata e risintetizzata con grande rapidità e ha una vita media molto più breve degli altri RNA;
RNA transfer (tRNA), costituito da piccole molecole di circa 80 nucleotidi, con una peculiare forma a “trifoglio data da ibridazioni tra le basi, responsabili della lettura e traduzione del codice genetico;
RNA ribosomiale (rRNA) che è la forma più abbondante e stabile presente nei ribosomi citoplasmatici.




Rappresentazione dei tre tripi di RNA.

I ribosomi procariotici contengono 3 diverse molecole di rRNA, quelli eucariotici contengono quattro tipi di rRNA, che normalmente vengono identificati per la loro diversa velocità di sedimentazione nella centrifugazione: 28S (circa 5000 nucleotidi), 18S (circa 2000), 5.8S (circa 160) e 5S.
I ribosomi sono i siti della sintesi proteica; sono costituiti da due subunità proteiche: quella più piccola, inferiore, che presenta solo un sito di aggancio per l’mRNA, e quella più grande che invece possiede due siti di aggancio per il tRNA.
In una cellula eucariotica meno del 10% dell’RNA totale cellulare è rappresentato dall’mRNA, circa il 1020% costituisce il tRNA, mentre circa il 7080% è formato da rRNA.
Il sistema attraverso cui tali informazioni arrivano a operare la sintesi di tutte le proteine necessarie alla vita degli organismi è detto codice genetico.
Il codice genetico è il linguaggio chimico costituito da un “alfabeto" molecolare di 4 “lettere" che corrispondono alle 4 diverse basi azotate: esso rappresenta la corrispondenza fra una serie di sequenze di 3 nucleotidi e gli specifici 20 amminoacidi.
Utilizzando gruppi di 3 nucleotidi (triplette, o codoni) si ottengono 43 = 64 combinazioni diverse, perciò uno stesso aminoacido è codificato da più di una tripletta.
Per questo motivo il codice genetico viene definito degenerato. Poiché le triplette che codificano lo stesso amminoacido sono molto simili e generalmente differiscono solo per l’ultima delle tre basi, si ipotizza che siano le prime due basi a contenere l’informazione fondamentale, mentre la terza serve a garantire una maggiore precisione. La tripletta AUG è il codone d'inizio della sintesi proteica sia negli eucarioti che nei procarioti e codifica per l’amminoacido metionina. Tre triplette, UAA, UAG, UGA non corrispondono a nessun amminoacido perciò sono dette triplette non senso o codoni stop perché servono a segnalare la fine della catena proteica.
Nessun codone specifica per più di un amminoacido, per cui il codice non è ambiguo. La sequenza di triplette che codifica una proteina è il gene. Quasi tutti gli esseri viventi usano il medesimo codice genetico, chiamato codice genetico standard.


4 Geni, cromosomi e genoma

I geni sono i segmenti di DNA che portano in codice l'informazione per produrre (tecnicamente codificare) una proteina.
La serie completa dei geni presenti nel corredo cromosomico di un individuo costituisce il suo corredo genomico o genoma.
Negli organismi più semplici, i batteri cosiddetti procarioti, il DNA non è circondato da una membrana, ma è libero nel citoplasma cellulare a formare un unico cromosoma circolare. Tutte le funzioni vitali, replicazione e produzione di proteine sono svolte nello stesso citoplasma.
Negli organismi eucarioti, dai lieviti ai mammiferi, il DNA è protetto da una membrana e le funzioni cellulari sono rigorosamente ripartite all’interno della cellula tra nucleo e citoplasma. All’interno del nucleo, il DNA (2 metri di lunghezza e 3 miliardi di paia di basi nell’uomo) si trova impacchettato attorno a proteine molto semplici, gli istoni, che hanno il compito di renderlo inattivo e di ridurne il volume per poterlo contenere al proprio interno: il nucleo misura appena 5x 10~m. L’insieme DNAistoni costituisce una struttura definita nucleosoma. Più nucleosomi si dispongono in sequenze a formare la cromatina che, ripiegandosi a spirale come una molla, darà origine a un bastoncino rugoso detto cromosoma. Il cromosoma perciò assomiglia a una collana strettamente raggomitolata, le cui perle sono i nucleosomi.


9 (a) Struttura di un nucleosoma; (b) nucleosomi ammassati e cromatina; (c) il cromosoma.

All’estremità dei cromosomi sono presenti alcune sequenze di DNA e proteine dette telomeri che hanno una funzione protettiva ed evitano la perdita di informazioni durante la duplicazione dei cromosomi. Nella maggior parte dei mammiferi la sequenza telomerica è sempre la stessa ed è TTAGGG. Sembra che i telomeri abbiano un ruolo importante nel determinare la durata della vita di una cellula e nell’invecchiamento. A ogni duplicazione, infatti, si accorciano.


10 Accorciamento dei telomeri in relazione al progressivo invecchiamento dei cromosomi.

Al momento della divisione cellulare il DNA del cromosoma si duplica e si struttura in forme di due bastoncelli, i cromatidi, uniti da un tratto di DNA non duplicato (centromero).
Alcuni segmenti di DNA, detti trasposoni o elementi trasponibili, hanno la capacità di cambiare posizione all’interno del genoma e di acquisire nuove posizioni. Nei procarioti gli elementi trasponibili possono inserirsi in una nuova posizione del cromosoma oppure sulla sequenza di un plasmide; negli eucarioti possono muoversi sullo stesso cromosoma o spostarsi su cromosomi diversi. Tali segmenti possono provocare variazioni nell’espressione e nell’attività dei geni adiacenti al loro punto d’inserzione fino al caso in cui se si inseriscono in una sequenza codificante provocano l’inattivazione del gene.
Il materiale ereditario è quindi un messaggio e, volendo fare un paragone con gli elementi che compongono la comunicazione scritta, si può dire sia strutturato nel modo seguente:


La quantità del DNA presente nelle cellule dei vari organismi è detta genoma. I genomi delle varie specie sono diversi fra loro per dimensioni e struttura; in genere sono più grandi man mano che si sale nella scala della complessità: i genomi dei procarioti sono meno ampi rispetto a quelli degli eucarioti e, restando nel mondo vegetale, le Fanerogame hanno genomi di dimensioni maggiori rispetto a quelle delle Crittogame.

Il fatto è intuitivo: più sono le funzioni che un organismo deve svolgere, più saranno i geni che codificano gli enzimi. Esistono però delle eccezioni: il genoma dell’uomo, ultimo arrivato nel cammino evolutivo, non è il genoma più complesso, ma esistono organismi con genoma molto superiore. Solo una parte del genoma in realtà si esprime con la produzione di proteine: nelle 23 coppie di cromosomi umani 100.000 geni codificano 100.000 proteine, ma rappresentano solo il 510% dell’intero genoma. Della parte restante non si conosce ancora bene la esatta funzione.
Il numero dei cromosomi assieme alla loro morfologia determina il cariotipo.
Ciascun cromosoma si presenta in due versioni dette cromosomi omologhi, una di origine paterna e una di origine materna, contenute nelle cellule diploidi, che si appaiano durante la meiosi. I cromosomi sessuali si chiamano eterocromosomi mentre sono autosomi tutti gli altri cromosomi.
Ogni cromosoma è costituito da una serie di geni, ciascuno dei quali è organizzato in esoniintroni ed è affrancato da regioni con funzioni regolative dette regioni UTR (Un Traslated Region, regione non tradotta).
Gli esoni sono per la maggior parte organizzati in codoni e costituiscono la parte del gene che contiene le informazioni necessarie alla produzione di una proteina. A ogni codone corrisponde un amminoacido che costituisce la catena proteica. Gli introni non hanno funzioni codificanti, ma possono essere sequenze con funzioni regolatrici in grado di aumentare o diminuire la sintesi delle proteine.
A monte del gene in posizione 5’ si trovano generalmente i promotori che sono sequenze di DNA che innescano la sintesi proteica mentre a valle del gene in posizione 3’ si trovano regioni regolative che contengono i terminatori, sequenze in grado di bloccare la trascrizione di un gene.

Approfondimenti
Il Progetto genoma umano
Nel 1990, presso il National Institutes of Health, negli Stati Uniti, fu avviato il Progetto genoma umano, con l’obiettivo di sequenziare, identificare e dunque comprendere l’intero codice con cui è scritto il nostro DNA. Esteso su scala mondiale (vi parteciparono gruppi di ricerca sparsi in tutto il mondo) si concluse in prima bozza nel 2000.
Il progetto, a cui furono successivamente apportate numerose revisioni, si rivelò fondamentale per la comprensione del funzionamento e della struttura del genoma umano: con enorme sorpresa, ci si rese conto che il numero di geni era decisamente minore di quanto ci si sarebbe aspettati in un primo momento (nell’uomo il numero attualmente stimato è di circa 25.000 geni) e oggi appare chiaro come la maggiore o minore complessità di un organismo non dipenda dal numero di geni, quanto piuttosto dalla maggiore o minore complessità dei meccanismi di regolazione che sono alla base della differente espressione di un gene. La comprensione del genoma umano ha reso possibile la nascita della terapia genica, della farmacogenomica, della medicina preventiva; tuttavia, esso presenta anche alcuni aspetti e implicazioni di natura eticosociale e giuridica, che sono stati e sono ampiamente discussi a livello internazionale.
In futuro potrebbe essere possibile l’elaborazione di “carte d’identità genetica” individuali che, come le carte d’identità civili, potrebbero essere liberamente richieste o fornite d’ufficio, analogamente a quanto oggi avviene per i gruppi sanguigni e per altre analisi (test) di interesse sanitario. Oltre alla diagnosi prenatale, già praticata per la ricerca di alcune patologie, potrebbe divenire possibile una diagnosi preventiva di massa (screening) per l’identificazione di eventuali portatori di disfunzioni genetiche.
Gli individui portatori di malattie ereditarie potrebbero, in tal modo, premunirsi, prendendo le precauzioni igieniche e sanitarie necessarie e individuando quegli ambienti e comportamenti che dovrebbero accuratamente evitare. Tuttavia le analisi del genoma umano potrebbero essere impiegate secondo criteri e finalità eticamente e socialmente discutibili o inaccettabili. Numerosi sono i risvolti negativi e ambivalenti del progresso scientifico: lo screening dei lavoratori, ad esempio, per l’accertamento della predisposizione a determinate malattie, potrebbe risultare uno strumento discriminatorio all’atto dell’assunzione; oppure, nel campo delle assicurazioni, l’analisi genetica per verificare la predisposizione a determinate anomalie genetiche potrebbe indurre l’ente assicurativo a pretendere un aumento del “premio” in ragione della maggiorazione dei rischi; l’applicazione delle tecniche di analisi genomica in ambito giuridico, per l’accertamento della paternità o per l’individuazione di responsabilità penali, e i conseguenti problemi sollevati in ambito giudiziario potrebbero, qualora non si limitassero all’accertamento degli elementi pertinenti al processo, rivelare aspetti riservati della personalità dell’imputato.
Il Progetto genoma rappresenta un viaggio affascinante entro l’intima struttura dell’essere umano e, contemporaneamente, può essere il luogo ove ogni privacy viene azzerata. Le problematiche implicate sono ampie e complesse; come in tutti i problemi etici, il giudizio non può che essere ambivalente, come del resto è innegabile la necessità di un’adeguata regolamentazione giuridiconormativa dell’uso di tali conoscenze, a tutela delle persone interessate e del bene comune.


11 Corredo cromosomico umano maschile.

5 La sintesi delle proteine

L’informazione contenuta nel DNA dei geni è talmente importante che la cellula non può rischiare di danneggiarla, per cui esegue una copia di lavoro del gene corrispondente.
L’operazione di copiatura è detta trascrizione e consiste nella formazione di un acido nucleico, l’RNA, che viene usato come stampo per la produzione di una specifica proteina. Il percorso che porta alla formazione della proteina di svolge in due tempi: trascrizione e traduzione.

Trascrizione

La doppia elica di DNA si apre e si chiude al comando di opportuni indicatori solo per una parte, chiamata gene, che contiene le informazioni da “trascrivere e le copia sull’mRNA.
Esistono diversi tipi di geni; i principali sono quelli strutturali che codificano per proteine strutturali ed enzimi e quelli regolatori che codificano per proteine, la cui funzione è regolare l’espressione di altri geni. All’inizio e alla fine di ogni gene esistono sequenze, dette elementi genici regolatori, coinvolte nella regolazione dell’espressione genica.


Processo di trasformazione con in evidenza, a sinistra, la catena neoformata di RNA.

Un gene regolatore codifica una proteina in grado di controllare la trascrizione legandosi, sul DNA, a uno o più siti specifici.
Sia nei procarioti che negli eucarioti la trascrizione consta di tre fasi fondamentali, inizio, allungamento e terminazione, delle quali la prima e l’ultima sono dettate da specifiche sequenze nucleotidiche del DNA.
1.  La fase di inizio avviene grazie a un processo biochimico catalizzato dagli enzimi RNA polimerasi che, dopo aver riconosciuto uno specifico promotore, cioè una sequenza di nucleotidi che in genere si trovano subito a monte del gene da trascrivere (a monte significa verso l’estremità 5’ della sequenza di RNA o l’estremità 3’ del filamento di senso del DNA), svolgono la doppia catena di DNA e iniziano a muoversi sullo stampo. Soltanto una delle due eliche di DNA, detta elica stampo, viene trascritta in RNA.
2.  Nella fase di allungamento le RNApolimerasi aggiungono alla catena di RNA nuovi ribonucleotidi complementari alla sequenza di DNA del filamento stampo procedendo dall’estremità 3’ all’estremità 5’ e unendosi fra loro con un legame fosforico 3’ OH — 5’ OH. La doppia elica del DNA si riavvolge e la catena di RNA in formazione, detta trascritto, è via via rilasciata. L’insieme di tutti i trascritti (RNA messaggeri o mRNA) di un dato organismo o tipo cellulare è detta trascrittoma.
3.  La fase di terminazione si verifica quando la RNApolimerasi raggiunge specifiche sequenze di DNA chiamate terminatori. L’RNA polimerasi si stacca e l’RNA è rilasciato come trascritto.

Traduzione

Nei ribosomi, richiamato dalle triplette di mRNA, si avvicina un altro intermediario, il tRNA (RNA di trasporto), che possiede la tripletta complementare (anticodone) e trasportai’amminoacido.
Il tRNA è costituito da circa 80 nucleotidi, ha struttura bidimensionale ed è ripiegato a trifoglio per mezzo di legami a idrogeno. A una estremità vi è la tripletta chiamata anticodone che è specifica per un determinato codone dell’mRNA.
All’altra estremità il tRNA si lega all’amminoacido. Come la trascrizione anche la traduzione si svolge in tre fasi: inizio, allungamento e terminazione.
1. La fase di inizio comincia quando la subunità ribosomiale più piccola si attacca al filamento di mRNA presso l’estremità 5’, ponendo in evidenza il primo codone di questo filamento cui va ad appaiarsi l’anticodone del primo tRNA (il codone dell’mRNA di solito è (5’) AUG (3’), complementare all’anticodone (3’) UAC (5’) del tRNA). La combinazione fra subunità ribosomiale più piccola, tRNA e mRNA, è detta complesso d'inizio. Una volta che questo complesso si è formato, la subunità ribosomiale più grande si attacca a quella più piccola e il tRNA d’inizio va a collocarsi nel sito P (peptidico) della subunità più grande. L’energia necessaria per questa tappa è fornita dalla idrolisi della guanosina trifosfato (GTP).
2.  La seconda fase di allungamento prevede che la subunità minore scorra lungo l’mRna, permettendo al tRna legato alla subunità maggiore di leggere il messaggio e di far corrispondere alla specifica tripletta l’amminoacido giusto. Quando l’anticodone del tRNA riconosce il codone dell’mRNA l’amminoacido trasportato si lega all’amminoacido precedente con un legame peptidico. Il tRNA si stacca e si libera nel citoplasma.
3.  La fase di terminazione si verifica quando sull’mRna si trova il codone di stop (UGA, UAA.UAG) e non esiste nessun anticodone complementare sul tRna tale da associarsi a un amminoacido. Nella subunità maggiore si inserisce il fattore di terminazione che stacca la proteina mentre il ribosoma viene rilasciato e sospeso nel citoplasma.
I vari amminoacidi vengono assemblati secondo il messaggio codificato dall’mRNA. Il segnale di stop è dato da una tripletta non senso: la sintesi termina, la proteina si stacca dal ribosoma e acquista la propria struttura definitiva.
Un gene, una proteina è il motto che riassumeva il credo della biologia (dogma centrale) a metà degli anni ‘50 dello scorso secolo.
La proteina, che è sempre sintetizzata sui ribosomi nel citosol, può seguire due principali percorsi: la via citoplasmatica e la via secretoria. La prima riguarda le proteine destinate a rimanere nel citoplasma o a raggiungere il nucleo, i mitocondri, i cloroplasti e i perossisomi. Il percorso è intrapreso da proteine completate e rilasciate dai ribosomi e, poiché il processo avviene dopo che la sintesi della proteina è giunta a completamento, è detto di traslocazione posttraduzionale.
La via secretoria, detta anche vescicolare, interessa le proteine che andranno a far parte delle membrane come proteine intrinseche, localizzandosi nei lisosomi, nel reticolo endoplasmatico e nell’apparato di Golgi. Queste proteine entrano nel reticolo endoplasmatico (ER) mentre sono ancora in fase di sintesi e il processo viene perciò chiamato traslocazione cotraduzionale.
È la composizione in amminoacidi della proteina a decretarne la destinazione perché può contenere segnali di smistamento in grado di dirigerne la consegna verso posizioni fuori dal citosol. Si tratta di alcune corte sequenze di circa 20 amminoacidi idrofobici, dette sequenze segnale, che vengono riconosciute da una particella di riconoscimento del segnale (SRP) formata da 6 proteine e da un piccolo RNA citoplasmatico (srpRNA).


13 Processo di traduzione.


14 (a) Via citoplasmatica: lo smistamento avviene dopo il completamento della traduzione. (b) Via secretoria: lo smistamento avviene durante la traduzione.

Una peptidasi di segnale rimuove dalla proteina queste sequenze segnale, una volta che lo smistamento è completato.
Anche se la maggior parte delle proteine non contiene nessun segnale di smistamento e resta, quindi, aU’interno del citosol, il movimento delle altre proteine da un compartimento all’altro all’interno di una cellula può avvenire attraverso tre meccanismi principali, ciascuno dei quali è guidato da particolari segnali di smistamento presenti nelle proteine trasportate e riconosciuti dai SRP complementari.
1.  Trasporto attraverso i pori: avviene tra citosol e nucleo, dove i pori nucleari fungono da cancelli selettivi che trasportano attivamente grossi complessi macromolecolari.
2.  Trasporto transmembrana: è operato da proteine traslocatrici, legate alla membrana, che trasportano direttamente alcune proteine specifiche dal citosol in uno spazio distinto (ER o mitocondrio).
3.  Trasporto vescicolare: avviene attraverso vescicole di trasporto passando da un compartimento a un altro.

BIOLOGIA APPLICATA E BIOTECNOLOGIE AGRARIE
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GENETICA, TRASFORMAZIONI, AGROAMBIENTE