Agricoltura sostenibile, biologica e difesa delle colture

158 Appendice - Parte 1a FOCUS La tecnica di laboratorio prevede in prima fase la denaturazione del DNA (fase 1) alla temperatura di 94-99 °C, detta temperatura di fusione, cioè la separazione dei due filamenti della doppia catena [ 18 ]. Segue poi la fase di annealing (fase 2), ossia l appaiamento di tratti complementari della catena aperta con brevi sequenze dette primer, lunghe in genere 20-30 basi e possibilmente senza sequenze complementari reciproche per evitare il rischio che si aggreghino tra loro, anziché sulla molecola di DNA da duplicare. quindi indispensabile per produrre artificialmente i primer e averli a disposizione nei laboratori conoscere almeno in parte la mappa del DNA da testare (attualmente in commercio sono disponibili primer per moltissime specie di organismi). REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI INVERSA I primer costituiscono l innesco per la riproduzione del DNA e il processo avviene a una temperatura di 30-65 °C. Segue l estensione (fase 3), che consiste nella replicazione di tratti dei filamenti per mezzo dell enzima polimerasi in presenza di nucleotidi (come detto, in natura il processo di amplificazione avviene per merito di speciali enzimi chiamati DNA polimerasi); in laboratorio, attualmente è impiegato l enzima Taq-polimerasi che ha un picco di efficienza attorno ai 75-80 °C e ha un tasso di errore nella replicazione molto basso. In questa fase la temperatura è nuovamente rialzata per ottimizzare l attività dell enzima. Il ciclo viene ripetuto parecchie volte, 20-30 volte e anche più (exponential amplification) [ 19 ] (in teoria, a ogni ciclo il DNA campione dovrebbe raddoppiare, ma in pratica non è PCR - REAZIONE A CATENA DNA POLIMERASI 30-40 cicli per fase Fase 1 Denaturazione Una variante della tecnica della reazione a catena della polimerasi (PCR) è la reazione a catena della polimerasi inversa o Reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR). Essa consiste nella sintesi, mediante il processo di retrotrascrizione, di una molecola di cDNA a doppio filamento a partire da uno stampo di RNA amplificato mediante PCR classica. Tale tecnica è sfruttata in laboratorio per studiare l espressione genica di un organismo. Ultimamente è utilizzata per il rilevamento di RNA virale allo scopo di diagnosticare la malattia causata dal coronavirus SARS-CoV-2. Il test RT-PCR può essere eseguito su campioni respiratori ottenuti con vari metodi, tra cui un tampone rinofaringeo o un campione di espettorato. 1 minuto 94 °C 59 59 59 39 59 59 39 39 39 Fase 2 Appaiamento 59 45 secondi 51 °C 39 39 39 59 59 39 Fase 3 59 Estensione 2 minuti 72 °C 59 39 59 18 Schematizzazione delle tre fasi di laboratorio che permettono di replicare e aumentare la quantità del genoma studiato. gene cercato 3° ciclo 4° ciclo 2° ciclo Amplificazione esponenziale 35° ciclo 1° ciclo testo DNA GLOSSARY Denaturazione del DNA DNA denaturation Sequenziamento Sequencing 0120.Appendice.indd 158 19 Esemplificazione dei cicli della terza 22 = fase in cui si ha 4 copie l amplificazione esponenziale. 23 = 8 copie 24 = 16 copie 25 = 32 copie 236 = miliardi di copie 14/04/21 10:46

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