Appendice - Parte 1a

Mendel e la trasmissione dei caratteri

Test cross e la terza legge di Mendel

Per individuare il genotipo di un individuo, Mendel sviluppò un metodo chiamato test cross

Quando ci troviamo di fronte a un fiore rosso siamo certi che il suo DNA abbia entrambi gli alleli dominanti (RR) o ne possieda uno recessivo (Rr). Per scoprirlo è sufficiente incrociarlo (test cross) con un fiore bianco che di certo è omozigote per l’allele recessivo. Il rapporto con cui compaiono i nuovi individui ci dirà se il fiore rosso (fenotipo dominante) era omozigote o eterozigote [ 1 ]. 

Quando due individui differiscono per più caratteri, questi vengono ereditati indipendentemente, cosicché si possono trovare nella discendenza tutte le combinazioni possibili. 

Così recita la terza legge di Mendel detta anche legge dell’indipendenza: “i fattori che specificano per caratteri differenti assortiscono indipendentemente all’atto della formazione dei gameti e sono ereditati indipendentemente gli uni dagli altri”. 

Durante la meiosi i cromosomi si separano indipendentemente gli uni dagli altri [ 2 ]. Nel caso di due caratteri ad assortimento indipendente (incrocio a due fattori), le combinazioni possibili sono: 

• 9 dominanti per entrambi; 

• 3 dominanti per il primo, recessivi per il secondo; 

• 3 recessivi per il primo, dominanti per il secondo; 

• 1 recessivo per entrambi.

Eredità multifattoriale
Mendel fu in grado di scoprire le leggi che portano il suo nome perché i caratteri da lui esaminati erano monofattoriali, ossia dovuti all’azione di un solo gene. In realtà, nella maggior parte dei casi, i caratteri sono multifattoriali, ossia dipendono da più di un fattore genetico, spesso con l’aggiunta di fattori ambientali. Un carattere che dipende da due o più loci, con contributo variabile di fattori ambientali è detto carattere non mendeliano, o “multifattoriale”, e comprende tutte le possibilità di combinazione di fattori genetici e ambientali. 

Interazione fra alleli
Gli alleli che possono interagire fra loro sono alleli a dominanza incompleta e codominanti, alleli multipli e alleli letali. Non sempre fra gli alleli esiste un rapporto di dominanza e recessività e si possono verificare casi di dominanza incompleta quando la prima generazione F1, eterozigote, ha fenotipo con caratteri intermedi tra quelli dei due genitori omozigoti. Come si è visto, un tipico esempio è il colore dei petali della bocca di leone (Anthirrinum majus) e della bella di notte (Mirabilis jalapa): da genitori omozigoti per il colore rosso e omozigoti per il colore bianco nascono eterozigoti di colore rosa [ 3 ]. 
L’allele recessivo ha una sua influenza sul fenotipo, poiché la mancata produzione del pigmento dimezza la quantità del pigmento utile a dare il colore rosso. Nel caso in cui entrambi gli alleli si esprimano nel fenotipo e nessuno dei due domini sull’altro, si verifica la codominanza: i caratteri di entrambi i genitori si manifestano nella loro progenie F1. 
Un esempio è rappresentato dagli individui che hanno gruppo sanguigno AB (fenotipo AB dovuto alla presenza contemporanea di due alleli codominanti IA/IB). Un altro esempio è rappresentato dal colore del mantello dei bovini Shorthorn: quando un toro rosso è incrociato con una vacca bianca, in F1 i discendenti sono roani, una combinazione di rosso e bianco. Se un toro roano è incrociato a una vacca roana, il vitello ha una probabilità su quattro di essere bianco, due probabilità su quattro di essere roano e una probabilità su quattro di essere rosso. Infatti un allele del gene codifica per un enzima che produce il colore rosso del pelo, mentre l’altro allele codifica per il colore bianco: entrambi si esprimono in una mucca pezzata rosso-bianca (Roan cow) [ 4 ]. Quando per uno stesso gene esistono più di due alleli, si parla di alleli multipli
Ciò vuol dire che in una popolazione possono esserci tre, quattro, cinque e più alleli diversi, ma ogni individuo può averne nel proprio genotipo al massimo due diversi. Ad esempio la pelliccia del coniglio può presentarsi in quattro fenotipi diversi (marrone, cincillà, bianco con macchie nere, bianco) che sono ereditari perché derivano da quattro alleli diversi: C, cch, ch, c. Si ottiene il fenotipo marrone quando l’individuo ha almeno un allele C e ciò significa che cch, ch, c sono recessivi rispetto a C. Il fenotipo cincillà si manifesta in assenza dell’allele C, ma a sua volta l’allele cch, che determina il fenotipo cincillà, è dominante rispetto a ch e c. 
Quindi i genotipi possibili per questo fenotipo sono tre [ 5 ]. Il fenotipo bianco con macchie nere può presentare a sua volta due genotipi possibili perché ch, recessivo rispetto a C e cch, è dominante rispetto a c. Infine c è recessivo a tutti gli altri alleli e avrà un solo possibile fenotipo: c-c. C’è quindi una scala di dominanza: 

1. C . 2. Cch . 3. Ch . 4. C 

Nelle piante gli alleli multipli più interessanti sono quelli che causano l’autoincompatibilità. In questo modo si impedisce al polline di impollinare gli ovuli della stessa pianta favorendo l’impollinazione fra piante diverse in modo da consentire il rimescolamento dei caratteri. In genere, un gene in un individuo diploide possiede solo due forme alleliche per cui, in caso di dominanza, si possono avere solo due tipi di fenotipi e in caso di dominanza incompleta tre tipi di fenotipi. Nella codominanza si hanno quattro o più fenotipi diversi. 
Gli alleli letali sono alleli che portano al decesso dell’organismo in una fase precoce dello sviluppo, spesso prima della nascita, e i geni che li contengono sono detti geni essenziali per la vita di un organismo [ 6 ]. 
Per esempio, il gene che codifica per una importante tappa metabolica, come la glicolisi, deve essere sempre espresso e funzionale, altrimenti l’embrione non può svilupparsi in quanto incapace di operare una fondamentale reazione biochimica, necessaria alla vita cellulare. Se l’allele letale è dominante, i portatori muoiono prima di riprodursi. Se invece l’allele è recessivo, può essere letale allo stato omozigote, ma non a quello eterozigote. Gli alleli letali furono scoperti nei primi anni del Novecento dal biologo francese Lucien Cuénot studiando il pigmento del mantello dei topi. Nella colorazione del mantello, infatti, sono coinvolti: l’allele Agouti (A) selvatico, al quale corrisponde un mantello grigio/nero, e l’allele AY (Y= Yellow, giallo) che causa la comparsa del mantello giallo. Questo allele è dominante sull’allele selvatico, ma in omozigosi AYAY non sopravvive.

Interazione fra geni 
Talvolta è l’azione combinata di due geni a dare luogo a un fenotipo diverso da quello prodotto da ciascun gene preso singolarmente e, perciò, 2 geni che controllano la stessa caratteristica danno 4 fenotipi differenti. 
Questo incrocio si differenzia dall’incrocio fra diibridi mendeliani perché in F2 si presentano due nuovi tipi (colore marrone e giallo) partendo da ascendenti nessuno dei quali presentava questo carattere. 
Un altro caso di interazione fra geni è rappresentato dal colore del peperone Capsiicum annuum: i geni interessati sono R (produce pigmento rosso), r (non sintetizza il pigmento), C (decompone la clorofilla), c (non decompone la clorofilla). In seconda generazione compaiono i fenotipi giallo e marrone poiché i quattro fenotipi RRCC, RrCC, RrCc, RRCc danno il colore rosso, Rrcc dà il colore verde, RRcc dà il colore marrone e rrCc dà il colore giallo. Quando per una determinata manifestazione fenotipica occorre la presenza di due o più geni, questi vengono definiti geni complementari [ 7 ]. In altri casi succede che un gene mascheri gli effetti di un altro e da due genitori omozigoti nascano individui con forme fenotipiche diverse. Il fenomeno prende il nome di epistasia; un esempio è rappresentato dal colore del pelo dei cani Labrador che è determinato da due coppie di geni: uno codifica per il pigmento e possiede l’allele B (pelo nero) e l’allele b (pelo marrone), l’altro è epistatico, codifica per la deposizione del colore nel pelo e possiede l’allele E (che esprime il nero/marrone) e l’allele e che blocca l’espressione [ 8 ]. In altri casi, invece, un gene può determinare, oltre a un carattere fenotipico principale, varie influenze secondarie e si parla quindi di pleiotropia. Ne sono esempi nel lupino il carattere fiore violetto, sempre legato al colore scuro dei semi, mentre il carattere alternativo fiore bianco è legato a semi bianchi. 
Il gene che determina il colore del mantello dei gatti ha effetto anche su occhi e orecchie. Gatti con mantello bianco e occhi blu sono sordi; gatti bianchi con un occhio blu e uno giallo-arancio sono sordi dalla parte dell’occhio blu [ 9 ]. A volte più geni localizzati su cromosomi diversi concorrono a determinare il carattere, come nell’uomo il colore della pelle, degli occhi, dei capelli, l’altezza, il peso, la pressione arteriosa, la longevità. 
Questi caratteri, detti poligenici, manifestano una vasta gamma di possibilità fenotipiche non facilmente correlabili col relativo genotipo. L’eredità poligenica è un fenomeno per cui i caratteri ereditari individuali sono spesso soggetti al controllo combinato da parte di più geni.

Interazione geni-ambiente 
Quando la manifestazione del carattere dipende non solo dal genotipo, ma anche dall’ambiente, il fenotipo è influenzato sia dai genotipi multipli che dai fattori ambientali. Durante la formazione e lo sviluppo di un organismo, la disponibilità e la qualità del cibo, la presenza di sostanze dannose, la temperatura o altri fattori ambientali interferiscono con l’attività di formazione dei vari caratteri. 
Un esempio è rappresentato dalle lepri artiche: il colore del pelo, pur determinato dai geni, dipende anche dalla temperatura dell’ambiente: è bianco in inverno e marrone in estate. Nel coniglio Himalayan la temperatura inferiore a 20 gradi produce pelliccia scura in corrispondenza delle estremità corporee [ 10 ]. 
Anche la lunghezza delle ali della drosofila è influenzata, anche se in maniera diversa nel maschio e nella femmina, dalla temperatura ambientale durante lo sviluppo [ 11 ]. 

Mappaggio genico: linkage e marcatori 
La fortuna, o l’abilità scientifica, di Mendel nel formulare questa legge deriva dall’aver incontrato caratteri determinati da geni che si trovavano su cromosomi differenti, così che essi segregavano indipendentemente. Durante la meiosi infatti, sono i cromosomi interi a segregare, e se i geni sono portati su uno stesso cromosoma segregano assieme. 
L’associazione di geni sullo stesso cromosoma si chiama linkage. In ogni organismo il numero dei linkage corrisponde al numero dei cromosomi dei gameti; tuttavia esistono vari gradi di associazione, poiché durante la meiosi si verifica fra i cromosomi omologhi uno scambio di geni detto crossing-over [ 12 ]. 
Le frequenze di crossing over danno una misura del grado di associazione e della distanza tra i loci. Più sono distanti, maggiore è la probabilità di ricombinazione mentre è molto raro un crossing over che porti alla separazione di due geni vicini.

In base all’associazione (quindi al linkage) dei geni è possibile costruire le mappe genetiche o mappe di concatenazione [ 13 ] che localizzano geni conosciuti sui cromosomi utilizzando specifici marcatori. 
Esistono tre tipi di marcatori: 
• i marcatori morfologici o fenotipici: si basano sulle caratteristiche visibili (ad esempio in Drosophila il colore degli occhi, del corpo, ecc.) e poiché si tratta di geni, cioè parti di DNA codificante, la loro posizione nel cromosoma si ricava attraverso incroci programmati sperimentali; 
• i marcatori biochimici: sono geni che codificano per prodotti biochimici, visibili solo mediante specifiche analisi, come la ricerca dei gruppi sanguigni o di una determinata proteina nel plasma o nel latte, o degli isoenzimi (forme alternative di uno stesso enzima, che svolgono la stessa funzione in un dato organismo anche se possono differenziarsi per uno o più amminoacidi); 
• i marcatori molecolari: non sono geni, cioè non codificano per proteine, ma sono semplicemente tratti di DNA che vengono ereditati secondo le modalità mendeliane. Si trovano sparsi in tutto il genoma e sono caratterizzati da notevole polimorfismo, cioè esistono non solo in due alleli, ma in moltissime varianti alleliche. Oggi i marcatori a DNA, cioè microsatelliti, RFLP, VNTR e SNP sono i più usati, per l’analisi di linkage perché hanno permesso di definire il numero e la morfologia dei cromosomi, cioè il cariotipo o mappa cromosomica di molte specie di organismi.
Caratteri qualitativi e quantitativi 
I caratteri ereditari presenti in una popolazione sono le caratteristiche fenotipiche che vengono trasmesse in toto o in parte dai genitori ai figli e vengono distinti in qualitativi e quantitativi. I primi sono anche detti caratteri discontinui perché possono apparire o non apparire, presentano cioè una variabilità discontinua
Sono difficilmente misurabili e si trasmettono secondo le leggi di Mendel in quanto dipendono dall’azione e dall’interazione di uno, due o comunque pochissimi geni. Ne sono un esempio i gruppi sanguigni nell’uomo, il colore dei petali di alcuni fiori, la forma dei semi di pisello e della cariosside del mais, il colore del pelo del gatto, la presenza/assenza di corna nei bovini, ecc. Tali caratteri, che sono anche chiamati mendeleiani, si presentano in un numero ridotto di fenotipi, ciascuno dei quali dipende strettamente dal genotipo che li determina. Non hanno grande rilevanza economica e si differenziano dalla maggior parte dei caratteri che, invece, possono essere misurati e analizzati mediante parametri numerici e sono, perciò, quantitativi come ad esempio la statura, il peso, il colore della pelle nell’uomo o i numerosi caratteri su cui l’uomo agisce per ottenere maggiore produttività da piante coltivate e animali domestici, come dimensioni e qualità organolettiche di verdura, semi, frutti o carne, latte, uova. I caratteri quantitativi sono anche detti continui perché mostrano un arco continuo di manifestazioni tra espressioni estreme (minimo e massimo) presentando una variabilità continua. Si tratta di caratteri poligenici, cioè trasmessi da più geni presenti su più coppie di cromosomi omologhi, che non seguono le regole della trasmissione mendeliana, ma vengono studiati con metodi statistici. Ogni carattere, infatti, è determinato dall’azione congiunta di un numero più o meno grande di geni, ciascuno dei quali non ne definisce la presenza o l’assenza (come nel caso dei caratteri mendeleiani) ma contribuisce alla sua intensità, fornendo una piccola quantità del carattere in oggetto. Il fenotipo che si sviluppa è il risultato della somma di tutti questi piccoli effetti. Ciò è detto effetto additivo o cumulativo cioè ogni gene influisce in piccola parte sul carattere, ne consegue che i fenotipi controllati da geni con effetto additivo hanno grande variabilità perché ciò che viene cambiato non è la quantità ma solo l’intensità del carattere. Se il numero di geni a effetto additivo è elevato, la distribuzione fenotipica tende a diventare continua e la rappresentazione grafica dei dati è la curva di Gauss o Gaussiana detta anche (per la sua forma) curva a campana [ 14 ]. Si tratta di una curva che ha un massimo attorno alla media dei valori misurati e può essere più o meno stretta a seconda della dispersione dei valori attorno alla media. 
La dispersione si misura con la deviazione standard. Per esempio se considerassimo la statura degli italiani maschi analizzando un campione di 1.000 individui e rappresentassimo su un grafico le misure effettuate, otterremmo una curva a campana centrata attorno a una media di 175 cm, con una deviazione standard di circa 20 cm, cioè il 95% dei soggetti analizzati avrebbe un’altezza compresa fra 155 cm e 195 cm [ 15 ]. 
Questo andamento è possibile a condizione che tutti gli individui abbiano goduto, durante lo sviluppo, delle stesse condizioni di vita come ad esempio una alimentazione equilibrata, tuttavia un individuo che, pur avendo un genotipo che gli consentirebbe di raggiungere un’altezza superiore alla media, ma che non si sia alimentato adeguatamente non sarà in grado di ragguagliare tali valori e resterà più basso [ 16 ]. 
Da ciò si deduce che nella manifestazione dei caratteri quantitativi l’ambiente in cui l’individuo si sviluppa gioca un ruolo molto importante e, anzi, più forte è l’effetto dell’ambiente, maggiore è il numero dei fenotipi che si possono sviluppare. Il fenotipo dei caratteri quantitativi è perciò condizionato da due fattori non sempre facilmente distinguibili fra loro: dal genotipo in quanto dipende dall’azione e dall’interazione di numerosi geni; dall’influenza dell’ambiente che introduce, nell’ambito di ciascun genotipo, nuove variazioni.

Le biotecnologie molecolari
Considerando i vari livelli di organizzazione dei viventi, si può affermare che il livello cellulare [ 17 ] manifesta un sottostante livello di organizzazione interna definito molecolare
Lo studio circa la struttura e le relazioni che intercorrono fra le molecole organiche complesse presenti nella cellula è obiettivo primario della biologia molecolare il cui dogma centrale (“un gene-una proteina”) stabilisce come, nei sistemi biologici, il flusso delle informazioni passi dal DNA all’RNA e da questo alle proteine. 
Queste molecole hanno dimensioni gigantesche e sono definite macromolecole: esse hanno un ruolo determinante nel regolare tutte le attività della cellula e dell’intero organismo e vengono sintetizzate solo dagli esseri viventi essendo caratterizzate, nella loro composizione chimica, dalla presenza del carbonio (elemento che ha la capacità di instaurare un numero molto elevato di legami chimici). 
Una sempre più approfondita conoscenza delle parti elementari e dei modi in cui queste molecole si integrano e si organizzano, nonché dei fattori dell’eredità (cromosomi, geni) e delle loro funzioni nella variabilità genetica che si verifica nel prosieguo delle generazioni, consente di raggiungere risultati sempre più efficienti nei confronti delle attività umane: in ambito sanitario (vaccini più sicuri, medicinali contro disfunzioni metaboliche a base genetica, antitumorali più efficaci e meno dannosi per l’organismo, stimolatori delle difese immunitarie) e agroambientale (sviluppo di metodiche di biomonitoraggio e biorisanamento tramite l’impiego di enzimi e microrganismi procarioti ed eucarioti). 
Le modalità d’indagine applicano tecniche che provengono anche da varie altre discipline, quali la biochimica, la fisica e la genetica e trovano applicazione nell’ingegneria genetica (detta anche tecnologia del DNA ricombinante) e nella biotecnologia molecolare. 
Poiché, per gli studi di biologia molecolare, le strumentazioni attuali non riescono a identificare e a utilizzare soltanto poche molecole di DNA, è stata messa a punto (cosa che è di fondamentale importanza) la tecnica della PCR che consente di avere una grande quantità di copie di una molecola dell’acido nucleico. 

La reazione a catena della polimerasi 
Comunemente nota con l’acronimo PCR, è una tecnica di biologia molecolare che consente la moltiplicazione (amplificazione) di frammenti di acidi nucleici dei quali si conoscano le sequenze nucleotidiche iniziali e terminali. 
L’amplificazione mediante PCR consente di ottenere in vitro molto rapidamente la quantità di materiale genetico necessaria per le successive applicazioni. 
Il processo di amplificazione del DNA avviene in natura per azione di enzimi speciali chiamati DNA polimerasi, capaci di sintetizzare una nuova molecola di DNA purché siano disponibili nucleotidi in forma di desossiribonucleotidi- trifosfato (dNTP) e se le eliche del DNA da replicare sono separate. 
Non è possibile sintetizzare una molecola ex novo, ma solo prolungare quella esistente in idonee condizioni (temperatura e pH). 

FOCUS

REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI INVERSA

Una variante della tecnica della reazione a catena della polimerasi (PCR) è la reazione a catena della polimerasi inversa o Reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR). Essa consiste nella sintesi, mediante il processo di retrotrascrizione, di una molecola di cDNA a doppio filamento a partire da uno stampo di RNA amplificato mediante PCR classica. Tale tecnica è sfruttata in laboratorio per studiare l’espressione genica di un organismo. Ultimamente è utilizzata per il rilevamento di RNA virale allo scopo di diagnosticare la malattia causata dal coronavirus SARS-CoV-2. Il test RT-PCR può essere eseguito su campioni respiratori ottenuti con vari metodi, tra cui un tampone rinofaringeo o un campione di espettorato.

La tecnica di laboratorio prevede in prima fase la denaturazione del DNA (fase 1) alla temperatura di 94-99 °C, detta temperatura di fusione, cioè la separazione dei due filamenti della doppia catena [ 18 ]. 
Segue poi la fase di annealing (fase 2), ossia l’appaiamento di tratti complementari della catena aperta con brevi sequenze dette primer, lunghe in genere 20-30 basi e possibilmente senza sequenze complementari reciproche per evitare il rischio che si aggreghino tra loro, anziché sulla molecola di DNA da duplicare. 
È quindi indispensabile - per produrre artificialmente i primer e averli a disposizione nei laboratori - conoscere almeno in parte la mappa del DNA da testare (attualmente in commercio sono disponibili primer per moltissime specie di organismi). 
I primer costituiscono l’innesco per la riproduzione del DNA e il processo avviene a una temperatura di 30-65 °C. 
Segue l’estensione (fase 3), che consiste nella replicazione di tratti dei filamenti per mezzo dell’enzima polimerasi in presenza di nucleotidi (come detto, in natura il processo di amplificazione avviene per merito di speciali enzimi chiamati DNA polimerasi); in laboratorio, attualmente è impiegato l’enzima Taq-polimerasi che ha un picco di efficienza attorno ai 75-80 °C e ha un tasso di errore nella replicazione molto basso. In questa fase la temperatura è nuovamente rialzata per ottimizzare l’attività dell’enzima. Il ciclo viene ripetuto parecchie volte, 20-30 volte e anche più (exponential amplification) [ 19 ] (in teoria, a ogni ciclo il DNA campione dovrebbe raddoppiare, ma in pratica non è così ed esistono formule matematiche per valutare l’efficienza dell’amplificazione) finché non si ottiene la quantità di DNA prevista dai protocolli. 
La quantità iniziale di materiale bersaglio è bassissima, fino all’ordine di 10 μg; anzi, quantità di DNA di partenza relativamente alte possono far diminuire la resa del processo a causa della presenza di contaminanti. 
La lettura dei risultati è realizzata per mezzo di elettroforesi su gel o capillare [ 20 ]; quest’ultima impiega come mezzo separativo una colonna capillare di silice fusa: gli analiti, per azione di un campo elettrico, migrano da una estremità all’altra della colonna e vengono letti in base al loro assorbimento di luce (lettura elaborata da un computer e registrata in forma grafica).

Sequenziamento 
Il sequenziamento è una tecnica che serve a stabilire, con precisione, l’ordine delle basi in un frammento di DNA
Gli scopi per cui si applica tale tecnica sono molteplici: identificare mutazioni che causano patologie, paragonare i geni tra cellule in cui sono espressi e cellule in cui non sono espressi o sono espressi in parte, ricercare sequenze di regolazione, determinare la sequenza di una proteina corrispondente a una regione codificante, riconoscere i geni di un genoma. 
La tecnica del sequenziamento si compone di diverse fasi: 
1. preparazione del DNA stampo, sequenziamento con marcatura che consente di ottenere una serie di frammenti marcati con un’estremità fissa e una variabile; 
2. separazione usando elettroforesi su gel o elettroforesi capillare ad alta risoluzione; 
3. rilevazione di frammenti di DNA; 
4. lettura della sequenza usando l’autoradiografia (marcatura radioattiva) o la reazione con i fluorocromi (marcatura a fluorescenza). 
I metodi che si possono utilizzare per sequenziare il DNA sono descritti di seguito. 
1. Metodo chimico di Maxam e Gilbert attraverso cui il DNA è tagliato chimicamente in corrispondenza di basi specifiche e i prodotti di taglio sono analizzati su gel elettroforesi. Si preparano 4 miscele di reazione diverse (una per ogni base); in ogni miscela si producono frammenti di lunghezza diversa che vengono separati su gel di poliacrilammide. Il passaggio successivo è l’autoradiografia del gel. 
2. Metodo enzimatico di Sanger, detto anche dei terminatori di sintesi enzimatica o dei dideossi, in cui il DNA da sequenziare è replicato a partire da un primer radiomarcato. Il filamento neosintetizzato si spezza per la presenza di dideossi-nucleotidi che, mancando il gruppo OH al 3’, non consentono il formarsi del legame fosfodiesterico con il nucleotide successivo e analizzato con l’autoradiografia. 
3. Sequenziamento automatico del DNA in fluorescenza. È un sistema di lettura automatico che prevede l’utilizzo di nucleotidi trattati (fluorocromi). 
I prodotti di sintesi vengono fatti correre sulla stessa corsia di un gel denaturante, un laser eccita i fluorocromi, ciascuno dei quali emette una luce d’onda caratteristica e tramite un sistema automatizzato viene riportata su un personal computer la corretta sequenza nucleotidica del frammento analizzato.

Mappe geniche e marcatori molecolari (il caso della Vitis vinifera) 
La sequenza di immagini che seguono [ 21 ] rappresenta un esempio di mappa genetica raffigurante i cromosomi della specie Vitis vinifera, la vite coltivata. I cromosomi, che nella vite sono 19 coppie di cui la metà di origine materna e l’altra metà di origine paterna, vengono ricostruiti con software dedicati, capaci di calcolare le distanze tra diversi frammenti del DNA di cui conosciamo la sequenza, chiamati marcatori molecolari. 
Le sigle riportate lungo i 19 “bastoncini”, che rappresentano graficamente i cromosomi, definiscono ognuna un marcatore molecolare. La loro distribuzione lungo il cromosoma è stabilita in un primo tempo da calcoli probabilistici che definiscono le distanze genetiche, legate alla ricombinazione tra marcatori su cromosomi omologhi; in un successivo momento, tramite il sequenziamento del DNA della specie e grazie alla correlazione tra la mappa genetica e le sequenze di DNA dei cromosomi, le distanze genetiche vengono tradotte in distanze fisiche, ovvero in un numero definito di nucleotidi. I marcatori molecolari possono essere contenuti all’interno di geni oppure appartenere a regioni esterne a questi. Ovviamente i marcatori rappresentano un valore e hanno un potenziale diverso a seconda che definiscano o meno un gene, che si traduce in una proteina con una precisa funzione biologica. Un’elevata densità di marcatori molecolari posizionati sul genoma della vite è visualizzata sotto [ 22 ], dove si riportano ed evidenziano i dettagli del cromosoma 18. 
È importante sottolineare che molti geni posizionati su questo cromosoma sono correlati a resistenze genetiche nei riguardi di funghi patogeni della vite, in particolare Plasmopara viticola, volgarmente conosciuta come peronospora, uno dei patogeni fungini più dannosi per questa specie a livello mondiale.

Agricoltura sostenibile, biologica e difesa delle colture
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