99 Le moderne biotecnologie pratica non è così ed esistono formule matematiche per valutare l efficienza dell amplificazione) finché non si ottiene la quantità di DNA prevista dai protocolli. La quantità iniziale di materiale bersaglio è bassissima, fino all ordine di 10 ng; anzi, quantità di DNA di partenza relativamente alte possono far diminuire la resa del processo a causa della presenza di contaminanti. La lettura dei risultati è realizzata per mezzo di elettroforesi su gel o capillare [ 33 ]; quest ultima impiega come mezzo separativo una colonna capillare di silice fusa: gli analiti, per azione di un campo elettrico, migrano da una estremità all altra della colonna e vengono letti in base al loro assorbimento di luce (lettura elaborata da un computer e registrata in forma grafica). Fonte di luce Elettroforesi capillare LIBRO DIGITALE Capitolo 3 Computer Il gene portatore dell aromaticità dell uva Entrata dati + + + Catodo Rilevazione + + + Fotocatodo Uscita dati Registrazione cartacea Buffer (soluzione tampone) Anodo + Tempo (min) 33 Schema di struttura di laboratorio e di flusso, per la lettura dei dati dell esperienza tramite semplice elettroforesi. Sequenziamento Il sequenziamento è una tecnica che serve a stabilire, con precisione, l ordine delle basi in un frammento di DNA. Gli scopi per cui si applica tale tecnica sono molteplici: identificare mutazioni che causano patologie, paragonare i geni tra cellule in cui sono espressi e cellule in cui non sono espressi o sono espressi in parte, ricercare sequenze di regolazione, determinare la sequenza di una proteina corrispondente a una regione codificante, riconoscere i geni di un genoma. La tecnica del sequenziamento si compone di diverse fasi: 1. preparazione del DNA stampo, sequenziamento con marcatura che consente di ottenere una serie di frammenti marcati con un estremità fissa e una variabile; 2. separazione usando elettroforesi su gel o elettroforesi capillare ad alta risoluzione; 3. rilevazione di frammenti di DNA; 4. lettura della sequenza usando l autoradiografia (marcatura radioattiva) o la reazione con i fluorocromi (marcatura a fluorescenza). I metodi che si possono utilizzare per sequenziare il DNA sono descritti di seguito. 0100.Parte1_Cap_03.indd 99 1. Metodo chimico di Maxam e Gilbert attraverso cui il DNA è tagliato chimicamente in corrispondenza di basi specifiche e i prodotti di taglio sono analizzati su gel elettroforesi. Si preparano 4 miscele di reazione diverse (una per ogni base); in ogni miscela si producono frammenti di lunghezza diversa che vengono separati su gel di poliacrilammide. Il passaggio successivo è l autoradiografia del gel. 2. Metodo enzimatico di Sanger, detto anche dei terminatori di sintesi enzimatica o dei dideossi, in cui il DNA da sequenziare è replicato a partire da un primer radiomarcato. Il filamento neosintetizzato si spezza per la presenza di dideossi-nucleotidi che, mancando il gruppo OH al 3 , non consentono il formarsi del legame fosfodiesterico con il nucleotide successivo e analizzato con l autoradiografia. 3. Sequenziamento automatico del DNA in fluorescenza. un sistema di lettura automatico che prevede l utilizzo di nucleotidi trattati (fluorocromi). I prodotti di sintesi vengono fatti correre sulla stessa corsia di un gel denaturante, un laser eccita i fluorocromi, ciascuno dei quali emette una luce d onda caratteristica e tramite un sistema automatizzato viene riportata su un personal computer la corretta sequenza nucleotidica del frammento analizzato. 02/03/21 16:52