Parte 1 98 Biologia applicata, Biotecnologie, Agroambiente La tecnica di laboratorio prevede in prima fase la denaturazione del DNA (fase 1) alla temperatura di 94-99 °C, detta temperatura di fusione, cioè la separazione dei due filamenti della doppia catena [ 31 ]. Segue poi la fase di annealing (fase 2), ossia l appaiamento di tratti complementari della catena aperta con brevi sequenze dette primer, lunghe in genere 20-30 basi e possibilmente senza sequenze complementari reciproche per evitare il rischio che si aggreghino tra loro, anziché sulla molecola di DNA da duplicare. quindi indispensabile per produrre artificialmente i primer e averli a disposizione nei laboratori conoscere almeno in parte la mappa del DNA da testare (attualmente in commercio sono disponibili primer per moltissime specie di organismi). I primer costituiscono l innesco per la riproduzione del DNA e il processo avviene a una temperatura di 30-65 °C. Segue l estensione (fase 3), che consiste nella replicazione di tratti dei filamenti per mezzo dell enzima polimerasi in presenza di nucleotidi (come è detto, in natura il processo di amplificazione avviene per merito di speciali enzimi chiamati DNA polimerasi); in laboratorio, attualmente è impiegato l enzima Taq-polimerasi che ha un picco di efficienza attorno ai 75-80 °C e ha un tasso di errore nella replicazione molto basso. In questa fase la temperatura è nuovamente rialzata per ottimizzare l attività dell enzima. Il ciclo viene ripetuto parecchie volte, 20-30 volte e anche più (exponential amplification) [ 32 ] (in teoria, ad ogni ciclo il DNA campione dovrebbe raddoppiare, ma in FOCUS PCR - REAZIONE A CATENA DNA POLIMERASI 30-40 cicli per fase REAZIONE A CATENA DELLA POLIMERASI INVERSA Una variante della tecnica della reazione a catena della polimerasi (PCR) è la reazione a catena della polimerasi inversa o Reverse transcriptasepolymerase chain reaction (RT-PCR). Essa consiste nella sintesi, mediante il processo di retrotrascrizione, di una molecola di cDNA a doppio lamento a partire da uno stampo di RNA ampli cato mediante PCR classica. Tale tecnica è sfruttata in laboratorio per studiare l espressione genica di un organismo. Ultimamente è utilizzata per il rilevamento di RNA virale allo scopo di diagnosticare la malattia causata dal coronavirus SARS-CoV-2. Il test RT-PCR può essere eseguito su campioni respiratori ottenuti con vari metodi, tra cui un tampone rinofaringeo o un campione di espettorato. Fase 1 Denaturazione 1 minuto 94 °C 59 59 59 39 59 59 39 39 39 39 Fase 2 Appaiamento 59 45 secondi 51 °C 39 39 59 59 39 Fase 3 59 Estensione 2 minuti 72 °C 59 39 59 31 Schematizzazione delle tre fasi di laboratorio che permettono di replicare e aumentare la quantità del genoma studiato. gene cercato 3° ciclo 4° ciclo 2° ciclo Amplificazione esponenziale 35° ciclo 1° ciclo testo DNA GLOSSARY Denaturazione del DNA DNA denaturation Sequenziamento Sequencing 0100.Parte1_Cap_03.indd 98 32 Esemplificazione dei cicli della terza 22 = fase in cui si ha 4 copie l amplificazione esponenziale. 23 = 8 copie 24 = 16 copie 25 = 32 copie 236 = miliardi di copie 26/02/21 16:59