Le moderne biotecnologie di analizzare i meccanismi cellulari in un ambiente altamente controllabile dall operatore [ 2 ]. Sono sistemi abbastanza economici e rapidi nel tipo di risposta che ci possono dare e hanno disponibilità molto elevata e costi contenuti; inoltre, nel caso di colture cellulari animali, possono almeno in parte evitare il sacrificio di animali da esperimento. Strumenti per effettuare colture di cellule eucariote essenziale, in un laboratorio in cui si opera sulle cellule per mantenerle nelle migliori condizioni di sopravvivenza in vitro e permettere la loro proliferazione, la garanzia della sterilità dell ambiente e del materiale di lavoro. Allo stesso modo anche l operatore deve essere preservato dall esposizione ad aerosol e schizzi che si possono generare durante la manipolazione di materiale che potrebbe contenere agenti infettivi. Lo strumento progettato a questo scopo è la cappa di sicurezza biologica o microbiologica, spesso denominata cappa o cabina biohazard, la cui realizzazione è resa possibile grazie ai filtri HEPA (High Efficiency Particulate Air), che devono essere sostituiti periodicamente, e alla tecnologia del flusso laminare. GLOSSARY Biotecnologie cellulari Cell biotechnologies Colture cellulari Cell culture Terreno di coltura Culture medium/Growth medium 81 Capitolo 3 Si tratta di un flusso d aria unidirezionale formato da sottilissime strisce d aria sterili parallele che si muovono alla medesima velocità in tutti i punti, creando una corrente d aria omogenea e senza turbolenze. In un ambiente sterile così ottenuto, ogni contaminante libero nella zona di lavoro viene trascinato lontano da un fronte di aria sterile. Gli strumenti per sterilizzare i materiali sfruttano il calore secco o il calore umido. Nel primo caso sono stufe a secco utilizzate per sterilizzare la vetreria portandola a 150°/180 °C per 3 ore, nel secondo caso si usano le autoclavi con le quali si sterilizzano anche i terreni di coltura abbattendo perfino le spore; il processo dura una ventina di minuti a 121 °C con pressione di 2 atmosfere. Le condizioni ambientali ottimali per le colture sono create dall incubatore, strumento che all interno mantiene stabili alcuni parametri quali la temperatura a 37 °C, l umidità (circa il 98%) e una atmosfera di 5% CO2 per conservare il corretto pH 7,4 nella coltura. Un altro strumento indispensabile in un laboratorio biologico è la centrifuga da laboratorio, che viene utilizzata per separare i corpi di diversa densità attraverso l uso dell accelerazione centrifuga. L accelerazione per sedimentare le cellule senza danneggiarle è 300 giri x 5 minuti. Per osservare le cellule, soprattutto animali, mantenute in vita nelle colture in vitro, che non essendo colorate sono praticamente invisibili al microscopio ottico, il laboratorio deve essere dotato di un microscopio a contrasto di fase. Esso si basa sulle differenze di contrasto tra il campione da analizzare e il mezzo circostante, in modo tale da consentirne la visualizzazione senza ricorrere a metodologie di colorazione che spesso comportano modificazioni morfologiche e chimiche con morte delle cellule. Quando un preparato sottile è investito dalla luce, in parte la trasmette e in parte la diffrange. La luce diffratta risulta sfasata rispetto a quella trasmessa e in questi microscopi le differenze di fase sono trasformate in differenze di intensità luminosa. a 2 (a) Isolamento virale in tessuto animale ottenuto tramite inoculazione di colture cellulari recettive e luminescenti. (b) Le colture cellulari di Passiflora incarnata, pianta officinale contenente sostanze antiossidanti e precedentemente sottoposta a diversi trattamenti mutageni, hanno permesso di capire che la produzione di flavonoidi era considerevolmente aumentata nei soggetti trattati con raggi ultravioletti del tipo UV-B: questo tipo di radiazioni ha forte potere mutageno a carico del DNA nucleare. (c) Piastra Petri per l analisi dei meccanismi riproduttivi cellulari in ambiente sterile e controllato. 0100.Parte1_Cap_03.indd 81 c b 26/02/21 16:58