Virus e fitovirus Il dispositivo è un supporto cromatografico nitro-cellulosico su cui sono stati fatti seccare in bande successive da sinistra a destra: una prima linea di anticorpi anti-virus, specifici per un determinato virus, coniugati con tintura rossa di oro colloidale, preparati in coniglio; a Risposte Risposte Fasi campione campione del sano procedimento infetto Fase 1 Fase 2 Fase 3 Fase 4 a 271 Capitolo 7 una seconda linea con gli stessi anticorpi; una terza linea formata invece da anticorpi anti-IgG di coniglio; la striscia si chiude con materiale assorbente: questo serve a facilitare lo scorrimento del campione da saggiare, sotto forma di succo in soluzione, una goccia del quale viene infatti posta su un cuscinetto all inizio della striscia [ 25 ]. b Fase 1 - Sensibilizzazione della pianta: anticorpi policlonali purificati sono diluiti in un tampone di sensibilizzazione. Incubazione a 37 °C per 2 ore, segue lavaggio. Fase 2 - Aggiunta del campione: estratto grezzo, in tampone di estrazione, incubato a 4 °C per 16 ore, segue lavaggio. Fase 3 - Aggiunta del coniugato: sono anticorpi mono o policlonali, coniugati ad un enzima in un tampone specifico. Incubazione a 37 °C per 2 ore, segue lavaggio. Fase 4 - Aggiunta del substrato: specifico per l'enzima usato (p-nitrofenilfosfato per la fosfatasi alcali). Incubazione a temperatura ambiente per 1 ora. Arresto della reazione con NaOH. Lettura fotometrica. 24 (a) Rappresentazione dell ELISA diretta (DAS-ELISA = Double Antibody Sandwich-ELISA). L enzima coniugato è una fosfatasi alcalina che fa virare al giallo il substrato successivamente aggiunto. Nello schema sono omessi i diversi lavaggi eseguiti dopo ciascun passaggio, con i quali si provvede anche a eliminare l anticorpo coniugato (qualora non fosse stato catturato dalle particelle virali), in modo che il viraggio non abbia luogo in assenza dell antigene virale (da Belli). (b) Esiti di un test (presso Istituto Virologia Vegetale CNR). b Campione o ort e pp ent Su sorb as = antigene = anticorpi anti-virus o anti-IgG = oro colloidale in tintura rossa d c 0150.Parte2_Cap_07.indd 271 25 (a) Rappresentazione schematica del lateral-flow. Esempi di TSWV su: (b) gerbera; (c) melanzana; (d) pomodoro; (e) valeriana. e 26/02/21 17:01