Parte 2 270 Agroambiente, Produzioni vegetali e Difesa delle colture a b 23 Due momenti dimostrativi della fase di lettura del test diagnostico basato sulla tecnica PCR. (a) Si inietta in pozzetti su piastra di gel il DNA ottenuto per amplificazione dal frammento di materiale nucleare originario, opportunamente preparato con addensanti e coloranti affinché il campione non scappi dal gel e la sua migrazione sia visivamente monitorabile per interrompere la corsa al momento opportuno. (b) L apparecchio viene chiuso e collegato agli elettrodi: la metodica di separazione in celle elettroforetiche si basa sul fatto che il DNA, avendo numerosi gruppi chimici fosfati, è dotato di carica elettrica negativa per cui, posto in un gel in campo elettrico a corrente continua (la cella elettroforetica della foto), migra dal polo - al polo +. Per effetto della matrice porosa del gel i frammenti molecolari più piccoli migrano più velocemente depositandosi molto lontano, così che alla fine si otterrà una serie di bande di ampiezza e disposizione caratteristiche in relazione al DNA testato. La rilevazione delle bande viene fatta trattando il gel con bromuro di etidio, che impregna il DNA ed è fluorescente ai raggi ultravioletti; ciò consente la lettura dei risultati dell elettroforesi (il gel è esaminato con un transilluminatore a luce UV) e quindi l elaborazione finale dei dati (il bromuro di etidio è una sostanza mutagena il cui impiego in laboratorio richiede l adozione di misure di sicurezza per l operatore; la stessa lastra viene poi bonificata a fine saggio). Poiché l intensità del colore è proporzionale alla concentrazione dell antigene presente, con questa metodica si ottiene anche una diagnosi di tipo quantitativo. Per la preparazione di anticorpi ci si serve di animali da laboratorio in cui il fitovirus è inoculato in modo da indurre una reazione del sistema immunologico dell animale. Il rivestimento capsidico si comporta infatti da antigene, nei confronti del quale i linfociti dell animale producono specifici anticorpi che si diffondono nel sangue, più esattamente nella frazione liquida (il siero). Un siero ricavato in questo modo è detto antisiero rispetto alla specie virale di partenza: esso, anche al di fuori del corpo dell animale che lo ha prodotto, è capace di dar luogo alla reazione antigene-anticorpo senza perdere la specificità. Gli anticorpi, dal punto di vista chimico, sono proteine chiamate immuno-globuline di cui esistono varie tipologie identificate con una sigla: quelle impiegate nei test sierologici sono le IgG. La metodica prevede alcune varianti raggruppate in due tipologie principali: ELISA diretta ed ELISA indiretta. Nel metodo diretto si sensibilizza la piastra con un anticorpo che intrappola le particelle virali successivamente introdotte con il campione da testare; quindi viene aggiunto l anticorpo coniugato che si lega a sandwich e infine il substrato su cui agisce l enzima e che lo fa virare di colore (il tutto viene regolato da tempistiche precise e lavaggi. Questo metodo offre il vantaggio della semplicità esecutiva a scapito, però, di qualche imprecisione per l interferenza provocata dall enzima coniugato [ 24 ]. Nei metodi indiretti (ad esempio TAS-ELISA = Triple Antibody Sandwich ELISA), più laboriosi ma con migliore reattività, sul virus catturato dal primo anticorpo è applicato un secondo anticorpo specifico preparato in animale diverso per evitare interferenze (il primo in pollo, il secondo in coniglio in quanto le IgG di uccelli e mammiferi non reagiscono tra loro). Segue un ulteriore passaggio con anticorpo anti-IgG, specifico per l anticorpo di coniglio e coniugato con la proteina enzimatica (esso proviene da un terzo animale, la capra, ed è detto coniugato universale perché non specifico per il virus). Il lateral-flow è un test diagnostico rapido di tipo immunocromatografico. 0150.Parte2_Cap_07.indd 270 FOCUS TEST RAPIDI ELISA La tecnologia ELISA attualmente è disponibile anche per test rapidi da effettuare in campo. Il saggio con ImmunoStrip è assai semplice: si preleva un frammento del campione (foglia) dove si sospetta sia presente il patogeno, lo si immette in una busta contenente una soluzione tampone, si schiaccia con una penna o altro per far uscire il succo, quindi si introduce direttamente nella busta la striscia e la si mette a contatto con il liquido (sono predisposti dei segni per guidare correttamente l operazione). Si attende il tempo prescritto, quindi si estrae la striscia e si legge il risultato in base alle istruzioni fornite. Sono in commercio kit per la diagnosi rapida di svariati patogeni (funghi, batteri, virus). 26/02/21 17:01