Parte 2 268 Agroambiente, Produzioni vegetali e Difesa delle colture Metodi diagnostici Per ciò che concerne la diagnostica delle malattie da virus e virus-simili, è bene ricordare che non sempre essi producono sintomi osservabili (e stato di sofferenza nella pianta) dai quali partire per imbastire un ragionamento diagnostico, in quanto l infezione può rimanere allo stato latente. Tuttavia, quando si presume la presenza di un virus e si rende necessario, ad esempio per motivi epidemiologici, verificare la consistenza del sospetto, si deve necessariamente ricorrere a metodiche di laboratorio, atte in ogni caso a rilevare e identificare (e a confermare se opportuno) il fitovirus. Oggi la diagnosi delle virosi segue criteri che, più esattamente, sono definiti metodi di rilevamento. In alcuni casi i virus provocano caratteristiche alterazioni, visibili in microscopia, entro la cellula infetta [ 21 ]. PIANTE INDICATRICI La diagnosi mediante l utilizzo di piante indicatrici è stata storicamente importante per gli agenti di malattie virali e virus-simili e ancora oggi trova impiego perché garantisce alti margini di affidabilità, è economica, è praticabile anche quando non si disponga di laboratori particolarmente attrezzati e infine non richiede competenze specialistiche. Questa metodologia consiste nel trasferire il virus, mediante inoculazione artificiale, dalla pianta presunta infetta a una sana di cui si conosca la suscettibilità a quel virus e che all infezione risponda con una sintomatologia esteriore ben visibile e caratteristica. Quali indicatori biologici si scelgono piante che si caratterizzano per rapida crescita e semplice coltivazione. Dal momento che un buon numero di virus è trasmissibile per contatto, in via generale l inoculazione viene praticata mediante semplice strofinamento di foglie della pianta indicatrice con succo della pianta infetta. Il succo si ottiene per triturazione di tessuti ammalati in soluzione tampone, mentre l area della pianta indicatrice su cui esso sarà strofinato viene previamente cosparsa con polvere abrasiva, in modo da provocare microferite attraverso cui i virus penetreranno. DETECTION METHODS: RILEVAMENTO E IDENTIFICAZIONE Il significato di questa procedura diagnostica è reso in italiano con i termini rilevamento e identificazione . Lo scopo è accertare la presenza del virus nei campioni vegetali e identificarne contestualmente la specie. Tali metodi si basano su diverse tecniche, che possono essere di tipo sierologico o molecolare, entrambe analoghe, anzi derivate, da quelle in uso in campo medico. La diagnosi sierologica, di cui esistono numerose varianti, sfrutta la reazione antigene-anticorpo. Poiché le piante non hanno un sistema immunologico, gli anticorpi vengono ricavati da cavie animali previamente inoculate con una data specie di fitovirus: l animale produrrà, nei confronti del virus specifici, anticorpi che vengono prelevati dal suo siero per allestire i reagenti di laboratorio. Questo antisiero viene fatto reagire con succo estratto dalla pianta da diagnosticare su un idoneo substrato: l avvenuta reazione è resa visibile grazie a sostanze che, per effetto di tale reazione, agiscono sul substrato modificandone il colore (questa tecnica è anche quantitativa, poiché l intensità del colore è proporzionale alla quantità di particelle virali presenti). Da quanto detto si tratta di tecniche che non servono genericamente a individuare la presenza di virus, ma ogni antisiero è specifico per un determinato fitovirus; quindi, nella pratica (non potendosi evidentemente effettuare tutti gli incroci possibili, se non altro per ragioni economiche), occorre che ci sia preventivamente una ipotesi diagnostica ottenuta mediante esperienza e osservazione dei sintomi visivi. La diagnosi molecolare, anch essa attualmente sviluppata in diverse varianti, sfrutta invece quelle tecniche di laboratorio che, partendo da una infinitesima quantità di acido nucleico (DNA, RNA) dell organismo da identificare, lo amplificano, ossia lo replicano artificialmente fino a ottenerne una quantità che può essere rilevata con opportuni accorgimenti e sistemi. 21 Sezione di tessuto vegetale infettato da un Potyvirus, in cui sono ben evidenti le caratteristiche formazioni a girandole dette pinwheels (a seconda della loro giacitura rispetto al taglio si presentano piatte di fronte oppure con diverse angolazioni). La microfotografia al microscopio elettronico permette inoltre di rendere visibili anche le particelle virali, che sono i sottili bastoncini sparsi un po ovunque. La barra di riferimento misura un micrometro (cortesia V. Masenga, Istituto Virologia Vegetale CNR). 0150.Parte2_Cap_07.indd 268 26/02/21 17:01