Le moderne biotecnologie ha consentito lo sviluppo di tecnologie molecolari e strumentali che permettono oggi di leggere le sequenze del DNA di geni e anche di interi genomi. Da circa una trentina d anni è possibile spezzettare i cromosomi e anche i singoli geni, di qualsiasi organismo e moltiplicarli in colonie batteriche o attraverso PCR, conservandoli in ordinate librerie genomiche o geniche utili per il sequenziamento del DNA o la produzione arti ciale di proteine in colonie batteriche da puri care in vitro per veri carne la funzione biologica. Questi frammenti di DNA di particolare interesse vengono poi mantenuti in colonie batteriche clonali (dove ogni cellula è identica all altra) in congelatori a 280 °C per un tempo pressoché illimitato. Sequenziamento di genomi e di geni Il sequenziamento è una procedura che ha come obiettivo quello di determinare l esatta sequenza di nucleotidi del DNA. All interno di questa sequenza sono codi cati i geni dell organismo in esame, nonché le istruzioni per esprimerli nel tempo e nello spazio (regolazione dell espressione genica) [ 59 ]. Sono state ideate diverse strategie per ottenere la sequenza nucleotidica del DNA. La prima era un metodo chimico, ideato da Maxam e Gilber nel 1965, seguito nel 1975 da una strategia enzimatica tutt ora diffusissima, il metodo di Sanger, che ricevette per questo il suo secondo premio Nobel. Recentemente sono state realizzate tecnologie estremamente innovative, come la tecnica detta di pirosequenziamento, estremamente rapide ma in grado di sequenziare solo da poche decine a alcune centinaia di nucleotidi per volta. La vite è stata la prima pianta arborea da frutto ad avere sequenziati i 480 milioni di nucleotidi che ne costituiscono il genoma. A questo lavoro hanno partecipato due progetti distinti: il primo ha visto protagonista l Istituto Agrario di San Michele all Adige (IASMA) in collaborazione con aziende private (Myriad Genetics Inc. e 454 Life Science); il secondo ha coinvolto un consorzio pubblico italo-francese che ha scelto di sequenziare, mediante il metodo Sanger, una linea altamente omozigote, originariamente derivata da un incrocio tra Pinot Noir ed una vecchia varietà, in seguito autofecondata per sei generazioni, al ne di facilitare l assemblaggio di 115 Capitolo 3 12 equivalenti genomici ed assegnare le funzioni biologiche dei geni identi cati. L IASMA ha utilizzato, invece, una strategia ibrida (Sanger e pirosequenziamento), sulla varietà Pinot Noir clone ENTAV 115 con obiettivi molteplici: l assemblaggio di 11 equivalenti genomici, l integrazione tra genoma e mappe genetiche, l identi cazione dei geni e la individuazione del massimo numero di polimor smi all interno di essi. Questi, sia in regioni geniche che inter-geniche, sono di grande interesse per i biologi addetti al miglioramento genetico. Il Pinot Noir studiato è, ad esempio, altamente eterozigote (polimor co) e presenta in pratica due genomi chiaramente distinguibili tra loro con una netta differenza in termini di sequenza nucleotidica, che ha permesso di identi care alcuni milioni di polimor smi a singolo nucleotide. Dati come questi e altri ottenuti con il risequenziamento di numerose varietà coltivate e selvatiche rappresentano una risorsa basilare per l analisi di tratti di interesse di natura quantitativa, a base genetica complessa. Post-genomica della vite La disponibilità di un così elevato quantitativo di informazioni permette di identi care i geni e le relative proteine che ogni tessuto e ogni organo della vite utilizza nelle più varie situazioni della vita della pianta. Entrati ormai nell era postgenomica della vite, ulteriori analisi, tramite strumenti come i DNA microchip che contengono in spazi ridottissimi di un quadrato di un centimetro di lato, l intero genoma depositato e l intero set di geni coinvolti in ogni fenomeno biologico che la pianta si trova ad affrontare, permettono di capire come questo fenomeno viene vissuto dalla pianta. Ad esempio, è oggi possibile confrontare, mediante l uso dei microchip, due tessuti fogliari che si trovano in situazioni profondamente diverse tra loro come un diverso livello nutritivo oppure in presenza o assenza di un patogeno fungino sulla super cie della foglia o della bacca. Questi strumenti consentiranno di intervenire in maniera mirata nel controllo sia dei patogeni, che in quello dei nutrienti o dello stato idrico della pianta, in modo tale che l intervento antropico sia mirato a ottenere una maggiore ef cienza e un maggiore rispetto per l ambiente e, di ri esso, una maggior soddisfazione del consumatore. DNA Vettore BAC Ligazione Trasformazione e crescita in Escherichia coli 58 Costituzione di una libreria genomica mediante vettori BAC. 0100.Parte1_Cap_03.indd 115 59 Cromatogramma che rappresenta la sequenza nucleotidica (DNA) di un gene di vite. 26/02/21 16:59