Parte 1 114 Biologia applicata, Biotecnologie, Agroambiente APPROFONDIMENTO 9 Genetica e genomica nella vite Mappe genetiche e mappe siche La vite è una pianta di grande importanza economica e culturale, di essa, nel corso degli ultimi decenni, sono state particolarmente approfondite le conoscenze biochimiche e genetiche, grazie alle notevoli opportunità offerte dalle informazioni sugli acidi nucleici (DNA e RNA) e, soprattutto, dalla possibilità di manipolarli in laboratorio. Dal punto di vista biochimico, infatti, tutti gli eventi metabolici, che hanno luogo all interno delle cellule dei diversi tessuti della pianta e che determinano la produzione e l accumulo di metaboliti di interesse viticolo-enologico sono analizzati in modo talmente dettagliato che ogni singolo gene o suo prodotto, la proteina, o le interazioni fra i singoli eventi biochimici sono oggetto di ricerca. Dal punto di vista genetico, sono molte le opportunità fornite dallo studio degli acidi nucleici. A differenza delle specie erbacee annuali, le ricerche di miglioramento genetico a breve termine della vite (come anche quelle delle altre specie legnose da frutto), hanno sofferto delle limitazioni dovute sia alla necessità di ampi spazi, indispensabili per raccogliere grandi collezioni di germoplasma o per lo studio delle numerose progenie ottenute da incrocio, sia ai lunghi tempi dei cicli biologici che intercorrono tra due generazioni e ai conseguenti elevati costi di gestione . Con la nascita di una nuova scienza, la genomica, che studia e consente di dedurre l intera informazione genetica contenuta nel genoma di un individuo, in termini sia di contenuto di DNA nei cromosomi della specie in esame, sia di struttura, funzione ed evoluzione del DNA stesso, si è realizzata una profonda svolta nella ricerca. Sulle distanze relative tra marcatori molecolari si fonda la costruzione di una mappa genetica. Questa può essere paragonata a una carta stradale che spiega le posizioni delle città lungo una strada: essa, infatti, illustra la disposizione dei geni sui cromosomi e le distanze genetiche tra i vari geni. Un informazione importante può essere, ad esempio, quella di sapere se geni con funzioni analoghe sono sullo stesso cromosoma e se sono vicini l un l altro. Lungo le mappe genetiche la distanza viene misurata in unità di mappa che corrisponde alla frequenza di ricombinazione (crossing-over durante la formazione dei gameti) pari all 1 % tra due geni. Quindi una unità di mappa è la distanza tra coppie di geni per i quali viene prodotto un ricombinante su 100. Le unità di mappa vengono chiamate anche centiMorgan (cM) in onore di T.H. Morgan, il primo a concludere che le frequenze di crossing-over per geni concatenati potessero essere correlate alla distanza che separa i geni sul cromosoma. Nella vite la maggior parte delle mappe genetiche di prima generazione era basata su marcatori molecolari anonimi. Recentemente lo sviluppo di marcatori molecolari funzionali (all interno dei geni), basati su polimor smi di un singolo nucleotide, ha consentito di rafforzare le basi per la mappatura di tratti di natura quantitativa e per l identi cazione di geni deputati a funzioni di interesse. Oggi, la mappa genetica di vite più densa è comprensiva di 1.134 marcatori molecolari distribuiti su 19 cromosomi omologhi e deriva dall integrazione dei risultati ottenuti da tre diversi incroci tra le varietà Pinot Noir, Syrah, Grenache, Cabernet Sauvignon e Riesling. Le mappe genetiche sono utili anche per l ancoraggio alle mappe siche. Lo sviluppo di mappe siche e la loro integrazione con mappe genetiche sono necessari per isolare ef cientemente e clonare geni di interesse applicativo. Una mappa sica è costituita da regioni (sequenze) fisicamente identificabili di DNA ed è costruita come un puzzle di frammenti di DNA di grandi dimensioni in parte sovrapponibili. La corretta disposizione dei frammenti viene controllata e confermata dalla presenza di numerosi marcatori molecolari, che sono già stati posizionati sulle mappe genetiche. Una mappa sica consiste, quindi, nell assemblaggio di larghi frammenti di DNA (cloni BAC XX) che si sovrappongono sulla base della loro similarità e della presenza di marcatori molecolari comuni. Si originano librerie geniche e genomiche il cui sviluppo nella vite è in continua crescita, sia per varietà di élite, come Pinot Noir e Cabernet Sauvignon, ma anche per viti selvatiche utilizzate per la ricerca dei geni che determinano le resistenze alle malattie più comuni. Queste librerie possono essere usate sia per lo sviluppo di mappe siche localizzate in cromosomi speci ci, sia per lo sviluppo di mappe siche dell intero genoma [ 58 ]. Marcatori molecolari I marcatori molecolari sono tecniche utili a individuare le differenze esistenti nel DNA tra diverse varietà di vite o anche all interno di una stessa varietà, rilevando le difformità tra due cromosomi omologhi a livello di singolo locus (cioè di una speci ca posizione su un cromosoma). La vite, come la maggior parte delle piante coltivate, è un individuo diploide, contiene cioè coppie di cromosomi omologhi per un totale di 38 cromosomi, di cui 19 di origine paterna e 19 materna, tra loro quasi identici, diversi solo per una piccola percentuale di nucleotidi che li compongono. Queste coppie di cromosomi si separano durante la meiosi, l evento biologico con cui vengono prodotti i gameti (polline e ovulo) negli organi riproduttori del ore (antere e ovari). Il granulo pollinico e l ovulo, che contengono ciascuno 19 cromosomi singoli si ricongiungono nelle 19 coppie di omologhi nello zigote (prima cellula embrionale), da cui si originerà l embrione contenuto nel seme all interno dell acino. I primi marcatori molecolari de niti anonimi rilevavano l esistenza delle variazioni nella sequenza dei nucleotidi della catena del DNA ma non identi cavano di quale differenza si trattava. Recentemente è stata scoperta una nuova categoria di marcatori molecolari che indaga variazioni o polimor smi di un singolo nucleotide (snp) oppure inserzioni o delezioni di pochi nucleotidi (da alcune decine a poche migliaia). Lo sviluppo di questa nuova categoria di marcatori è legata alla conoscenza della sequenza del DNA: non si tratta più di marcatori anonimi, ma identi cabili all interno di sequenze note, sia geniche che inter-geniche. Le differenze di singoli nucleotidi tra due cromosomi omologhi, e ancora di più tra cromosomi di varietà diverse, rappresentano oltre l 80%, no anche al 90%, delle differenze rilevabili. 0100.Parte1_Cap_03.indd 114 Librerie geniche e librerie genomiche La scoperta di elementi, i plasmidi, costituiti da DNA circolare e indipendenti dal cromosoma delle cellule batteriche, è stata una delle scoperte fondamentali della biologia e della genetica molecolari. La possibilità di spezzettare un intero genoma in frammenti di piccole e variabili dimensioni (da inserire e mantenere in elementi a DNA indipendenti che mimano un cromosoma arti ciale batterico, simile ad un plasmide detto BAC) 26/02/21 16:59