Clonaggio

Parte 1 108 Biologia applicata, Biotecnologie, Agroambiente I metodi fisici sono l elettroporazione, il gene gun, la microiniezione. Elettroporazione. Le cellule sono immesse in una soluzione contenente DNA e sottoposte a un breve impulso elettrico di voltaggio elevato (12,5-15 kV/cm) che produce una transitoria apertura dei pori della membrana, dai quali il DNA entra direttamente nel citoplasma [ 49 ]. Gene gun (letteralmente, cannone genico) [ 50 ]. Usa vere e proprie pistole che sparano ad altissima velocità nei tessuti particelle di oro rivestite del gene che interessa; queste particelle sono in grado di attraversare la membrana citoplasmatica e quella nucleare rilasciando il DNA nel nucleo delle cellule del tessuto bersaglio. Microiniezione. Si usano sottilissimi aghi di vetro, con i quali il DNA estraneo purificato viene iniettato nelle cellule. Clonaggio La replicazione di un frammento di DNA in molteplici copie uguali, utilizzando un microrganismo ospite, viene definita clonaggio. Il segmento di DNA di interesse viene inserito in una molecola di DNA in grado di replicarsi autonomamente (un cosiddetto veicolo o vettore ). Il risultante vettore chimerico ( DNA ricombinante ) è introdotto in un organismo ospite, in genere un batterio, che viene fatto riprodurre in modo da generare una popolazione numerosa: tutti i membri della popolazione conterranno molte copie del DNA ricombinante, ottenendo così quantità elevate del DNA inserito inizialmente. La tecnica consiste nei seguenti passaggi. 3. Ligazione: specifici frammenti di DNA vengono cuciti tra loro in modo covalente. Nella maggior parte dei casi questo compito è affidato alle ligasi, enzimi che catalizzano la formazione di legami fosfodiesterici tra estremità 3 -OH e 5 -P di molecole di DNA adiacenti, uguali (ligazione intra-molecolare) o diverse (ligazione inter-molecolare). 4. Introduzione dei vettori ricombinanti nell organismo ospite: se l ospite è un procariota, come E. coli, o un eucariota unicellulare, come S. cerevisiae, il metodo è detto trasformazione, mentre si parla di trasfezione se l ospite è un eucariota pluricellulare. 5. Inserimento dei marcatori di selezione nel vettore: servono a identificare le cellule trasformate (o transfettate). Si tratta di geni in grado di fornire un fenotipo particolarmente visibile o di permettere la sopravvivenza in certe condizioni ambientali, come i marcatori che conferiscono la resistenza a un antibiotico, per il quale l ospite utilizzato è sensibile. Solo le cellule che contengono il gene di resistenza all antibiotico saranno in grado di vivere in un terreno contenente quell antibiotico e di crescere e replicarsi cedendo anche alle cellule figlie il vettore di clonaggio. 6. Riproduzione del clone trasformato e conseguente amplificazione del numero di copie del DNA di interesse: i nuovi batteri, che contengono DNA di diversa origine, vengono chiamati batteri o cellule ricombinanti. Le cellule ricombinanti vengono prodotte su larga scala con una tecnica definita fermentazione. La proteina così ottenuta (quella codificata dal gene inserito nel plasmide) in grande quantità sarà purificata ed analizzata per determinare l eventuale presenza di contaminanti. 7. Analisi del DNA clonato mediante sequenziamento. 1. Isolamento e preparazione del DNA da clonare: il gene d interesse viene prima di tutto isolato dall organismo che lo possiede utilizzando la tecnica della PCR (Polymerase Chain Reaction) la quale permette di ottenere moltissime copie soltanto di questo gene, ignorando le regioni precedenti (a monte) e successive (a valle) ad esso. 2. Scelta e preparazione del vettore. 50 Gene gun che permette di inoculare particelle microscopiche ricoperte di DNA. FOCUS SIGNIFICATO DI CLONE 49 Dispositivo per l elettroporazione di cellule vegetali. 0100.Parte1_Cap_03.indd 108 Il termine clone assume signi cati diversi a seconda del contesto in cui viene usato. Se ci si riferisce all intero organismo, un clone è un organismo vivente geneticamente identico a quello da cui deriva. In biologia cellulare, invece, sono cloni i gruppi di cellule perfettamente identiche fra loro. In biologia molecolare, in ne, sono cloni le repliche identiche di una macromolecola (DNA) o di tratti di essa. 26/02/21 16:59

NUOVE Biotecnologie Agrarie e Biologia Applicata
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