107 Le moderne biotecnologie Il fago l è utilizzato per clonare frammenti di DNA lunghi fino a 25 kbp. Normalmente il genoma del fago è lungo 49 kbp, ma viene ridotto eliminando la porzione centrale con enzimi di restrizione che lasciano estremità coesive. I cosmidi ricombinanti vengono successivamente introdotti nella cellula batterica per trasduzione [ 46 47 ]. VETTORI NAVETTA (SHUTTLE) I vettori navetta sono vettori ingegnerizzati che possono replicarsi stabilmente in 2 diversi organismi: sono perciò compatibili con cellule diverse, ad esempio batteri/lieviti o batteri/animali. Genoma virale 55 nm Capitolo 3 Essi consentono, ad esempio, la manipolazione del vettore nelle cellule batteriche (E. coli) e il successivo trasferimento nelle cellule del lievito [ 48 ]. CROMOSOMI ARTIFICIALI Oggi sono stati messi a punto cromosomi artificiali con i quali è possibile utilizzare i batteri per clonare grossi pezzi di DNA (200-500 kbp). Essi contengono telomeri, centromero e il sito di replicazione autonoma. Sono cromosomi artificiali: YAC, cromosomi di lievito (Yeast Artificial Chromosomes); BAC, cromosomi batterici; MAC, cromosomi di mammifero; PAC, cromosomi P1. Trasferimento Testa 55 nm Volume 9 ? 1025 nm3 46 Schematizzazione della struttura del fago l. Coda 150 nm Per facilitare l ingresso delle macromolecole di DNA nelle cellule, sia batteriche che eucariote, comprese quelle umane, sono state sviluppate diverse tecniche basate su metodi chimici e fisici. I metodi chimici sono trattamenti con soluzioni fredde di cloruro di calcio, seguito da breve riscaldamento, che rendono le membrane permeabili al DNA. Fibre di coda 25 nm Fago Gene lievito 1° sito di restrizione cos cos terR 2° sito di restrizione Resistenza antibiotico Vettore navetta Sito di origine E. coli Cosmide Sito di origine lievito Replicone Resistenza antibiotico (tetraciclina) 1° ori E. coli Endonucleasi 1 Endonucleasi 2 Cromosoma batterico 2° Lievito Inserto da 40 kbp DNA-ligasi cos cos Cosmide ricombinante 50 kbp 47 Il cosmide, ridotto dalle endonucleasi, diventa ricombinante con l inserimento di segmenti di DNA lunghi 40 kbp. 0100.Parte1_Cap_03.indd 107 Cromosomi lievito 48 Schema operativo per l utilizzo dei vettori navetta. 26/02/21 16:59