Parte 1 106 Biologia applicata, Biotecnologie, Agroambiente Questo processo naturale attraverso il quale alcuni procarioti (detti competenti) sono in grado di ricevere del DNA esterno che dà origine a nuove caratteristiche, è sfruttato in laboratorio per far sì che i plasmidi siano vettori ideali per inserire geni esogeni e farli esprimere ai batteri. in questo modo, ad esempio, che per la prima volta si è riusciti a far sintetizzare a Escherichia coli insulina umana [ 44 ]. Per essere utilizzati come vettori, i plasmidi vengono aperti con lo stesso enzima di restrizione e addizionati per mezzo della ligasi con il frammento di DNA scelto e con geni per la resistenza a vari antibiotici, che permettono di selezionare solo quei batteri che hanno recepito il plasmide [ 45 ]. I batteri trasformati con il plasmide contenente DNA estraneo vengono fatti crescere su terreni contenenti uno o più antibiotici, e così solo quelli che hanno il plasmide possono sopravvivere, mentre gli altri muoiono. I geni per la resistenza agli antibiotici sono detti marcatori di selezione mentre il nuovo DNA è detto DNA ricombinante e i batteri, cellule ricombinanti. Gene per la resistenza a un antibiotico COSMIDI I cosmidi sono vettori artificiali che possono trasportare inserti di DNA di grandi dimensioni (30-45 kbp: kbp è l unità di misura delle sequenze di acidi nucleici; equivale a 1.000 paia di basi). Essi sono un ibrido fra i plasmidi e i virus poiché possiedono il replicone e la resistenza ad antibiotici come i plasmidi, nonché le estremità 5 -sporgenti di 12 nucleotidi, dette terminali coesivi (cos) del DNA del fago l, isolato dalle particelle virali. Gene inserito Gene per la resistenza a un antibiotico ENZIMI DI RESTRIZIONE Batterio trasformato Batterio non trasformato ENZIMI DI RESTRIZIONE PLASMIDE Terreno con antibiotico I TRASPOSONI ASI LIG 44 La produzione di un plasmide ricombinante consiste innanzitutto nel sottoporre il DNA sorgente (o donatore) a enzimi di restrizione che lo tagliano in frammenti, uno dei quali contiene il DNA bersaglio (inserto) con il gene di interesse. Successivamente gli stessi enzimi vengono usati per creare sul plasmide un punto di rottura complementare in cui poter inserire il DNA esogeno e saldare i frammenti del DNA sorgente al plasmide mediante l azione della DNA-ligasi. GLOSSARY Marcatori di selezione Selection markers Cosmidi Cosmides (DNA vectors) Cromosomi arti ciali Arti cial chromosomes FOCUS I AS LIG Gene inserito PLASMIDE RICOMBINANTE 0100.Parte1_Cap_03.indd 106 45 Tecnica di selezione di batteri ricombinanti operata dall antibiotico. Un ulteriore modalità di trasporto dei geni sia negli organismi procarioti sia negli eucarioti è rappresentata dai trasposoni o elementi trasponibili: sequenze di DNA, de nito mobile, che sono in grado di spostarsi autonomamente da una posizione ad un altra del cromosoma. Il meccanismo attraverso cui si muovono è detto di trasposizione e avviene grazie ad un enzima, la transposasi, codi cato dal trasposone stesso, che permette il loro inserimento, con un processo di ricombinazione, in zone diverse del DNA. Gli elementi trasponibili sono stati scoperti nel granturco dalla genetista americana B. McClintock che per questo nel 1983 ha ottenuto il premio Nobel per la medicina. La maggior parte dei trasposoni degli eucarioti sono detti retrotrasposoni perché traspongono copiandosi dapprima in un intermedio ad RNA che viene poi ritrascritto in DNA attraverso la trascrittasi inversa (codi cata anch essa da un gene del trasposone) e replicandosi poi in nuove posizioni all interno del genoma. Questo meccanismo permette di incrementare molto rapidamente la presenza delle loro copie all interno del genoma, aumentando la variabilità genetica e divenendo un importante strumento per introdurre mutazioni. c 26/02/21 16:59