Vettori genici

Parte 1 104 Biologia applicata, Biotecnologie, Agroambiente Il taglio può essere tronco o sfasato. Taglio tronco Taglio sfasato 59CCGG 59GAATTC 39GGCC 39CTTAA G I primi non danno possibilità di innesto tra due segmenti di DNA, poiché la loro cesura è netta, mentre i secondi, avendo estremità coesive, rendono possibile l innesto tra due segmenti di DNA (per questo sono i più utilizzati) [ 41 ]. Le estremità tagliate vengono di nuovo saldate assieme (con legame covalente per mezzo di altri enzimi colla , le ligasi). Ogni tipo di enzima taglia solo in corrispondenza di una specifica sequenza nucleotidica di riconoscimento. Ne deriva che possono esserci sia pezzi lunghi che corti e che un gene di una cellula eucariotica e un plasmide di un batterio, tagliati entrambi con lo stesso enzima di restrizione, si riconoscano e si uniscano perché hanno estremità coesive complementari. Le estremità sporgenti dei frammenti si associano e vengono saldate mediante legami idrogeno, generando una molecola di DNA chimerica o ricombinante. Ad esempio l enzima di restrizione EcoRI, si lega a sequenze specifiche di DNA in doppia elica GAATTC. Taglia in modo sfalsato i legami tra guanina e adenina su Enzimi di restrizione Ligasi 0100.Parte1_Cap_03.indd 104 I vettori genici sono sequenze di DNA di diversa natura (virus, plasmidi batterici, cosmidi, cromosomi artificiali) nelle quali è possibile inserire altre sequenze nucleotidiche. Tali strutture sono in grado di integrarsi con il DNA-bersaglio e di introdurvi il gene esogeno. La scelta del vettore dipende sia dalla natura della cellula bersaglio (animale, vegetale, procariote) che deve ricombinare il suo DNA, sia dalle dimensioni dell inserto genico che viene ospitato. CELLULA OSPITE VETTORI GENICI COMPATIBILI Batterio Plasmidi, fago l, fago M13, fago P1, PAC, BAC, YAC Lievito Plasmide 2 m, Plasmidi navetta (shuttle), vettori ARS, YAC Cellule animali Vettori derivati da virus Cellule vegetali Plasmidi derivati dal batterio Agrobacterium tumefaciens Enzimi di restrizione Enzimi di restrizione b Vettori genici In genere i vettori più usati per i batteri (E. coli) sono i plasmidi e i batteriofagi; per le cellule vegetali è un batterio parassita endocellulare di molte specie di piante, l Agrobacterium tumefaciens, il cui plasmide Ti è in grado di inserirsi nel genoma della cellula vegetale, mentre per le cellule animali si utilizzano prevalentemente vettori di natura virale. Un vettore, per svolgere la sua funzione, deve essere costituito da un segmento di DNA detto replicone che lo renda capace di replicarsi nella cellula ospite interagendo con gli enzimi coinvolti nell avvio della replicazione del DNA, composto da un origine di replicazione del DNA (ori) e dagli elementi di controllo a essa associati, nonché da uno o più marcatori genetici, come resistenze a antibiotici o marcatori nutrizionali la cui presenza permette di selezionare le cellule ospitanti. Al di fuori di queste regioni essenziali (replicone e marcatore) devono essere presenti singoli siti di taglio per il più alto numero possibile di enzimi di restrizione. Enzimi di restrizione a entrambi i filamenti (il taglio produce gruppi 3 -OH e 5 -fosfato), generando frammenti di DNA che hanno quattro basi sporgenti in singolo filamento alle estremità 5 . Il trasferimento di frammenti di DNA estraneo nelle cellule batteriche avviene a mezzo di un vettore. Ligasi 41 Formazione del DNA ricombinante: taglio dei palindromi per lo scambio dei (a) materiali genetici; (b) esemplificazione del taglio e successivo scambio tra DNA batterico e DNA umano per la formazione di DNA ibrido o ricombinante. 26/02/21 16:59

NUOVE Biotecnologie Agrarie e Biologia Applicata
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