Le moderne biotecnologie 6 103 Capitolo 3 L ingegneria genetica L ingegneria genetica comprende tutte quelle tecniche che consentono di trasferire ad alcune cellule viventi la capacità, ereditaria, di sintetizzare sostanze utili. Questo processo si svolge con una sequenza di più fasi: identificazione, isolamento, trasferimento del gene. L identificazione del gene [ 37 ] che produce una ben determinata proteina è forse la parte più complessa del processo. Innanzitutto bisogna conoscerne la localizzazione nel genoma, per poterlo isolare integro [ 38 ]. Negli eucarioti i geni sono molto discontinui e per ovviare a questo inconveniente si ricorre a un enzima, la trascrittasi inversa [ 39 ], che è in grado di costruire una molecola di DNA partendo dall mRNA corrispondente al gene desiderato: tale procedura consente di costruire una molecola di DNA duplex o cDNA sulla quale sarà facile lavorare. L isolamento avviene grazie a particolari forbici molecolari, gli enzimi di restrizione (endonucleasi) [ 40 ]. Presenti normalmente nei batteri, che li utilizzano per tagliare il DNA dei batteriofagi e restringere così la loro aggressività, gli enzimi di restrizione sono stati scoperti negli anni 60 del Novecento. Gli enzimi di restrizione sono endonucleasi che riconoscono e tagliano il DNA a livello di una specifica sequenza nucleotidica di 4-8 bp detta sito di restrizione. Poiché enzimi diversi riconoscono sequenze nucleotidiche diverse, ogni enzima ha una sua caratteristica specificità. Nei batteri essi costituiscono un sistema di difesa naturale che distrugge eventuali molecole di DNA estraneo proteggendoli da infezioni virali. Il nome di ciascun enzima di restrizione deriva dalle prime tre lettere, scritte in corsivo, prese dalla nomenclatura binomiale del batterio di origine, da una lettera maiuscola, che identifica un ceppo particolare di quel batterio, e da un numero romano che indica l ordine di scoperta, qualora dallo stesso batterio vengano isolati enzimi diversi. Ad esempio: Eco RI (si legge Eco erre primo ) deriva da Escherichia coli Ry13 (I enzima isolato), Eco RII da Escherichia coli R245 (II enzima isolato). Esistono due tipi di questi enzimi: alcuni tagliano di netto la molecola di DNA (taglio tronco), altri tagliano la molecola di DNA con una sfasatura di alcuni nucleotidi in specifiche sequenze di 4-6 nucleotidi, dette palindromi, che possono essere lette in entrambi i sensi senza mutare di significato. Il luogo in cui avviene il taglio è detto sito di restrizione. Batterio ricombinante cDNA mRNA Trascrittasi inversa Gene identificato Cellula donatrice Nuova proteina 37 Schematizzazione delle fasi in cui il gene, identificato e isolato, viene inserito in un altra cellula che produrrà una nuova proteina. G G 39 Visualizzazione dell utilizzo della trascrittasi inversa: il gene viene prima identificato, poi si forma il cDNA. Enzimi di restrizione C Trascrittasi inversa C G C A T T A A T G C C G C G A T T A A A9 A0 Enzimi di restrizione B B0 Ligasi A9 + B9 DNA mRNA cDNA 38 Identificazione del gene sulla catena nucleotidica e formazione del DNA duplex. 0100.Parte1_Cap_03.indd 103 40 Visualizzazione del processo di isolamento del gene con gli enzimi di restrizione e successiva saldatura con l utilizzo della ligasi. 26/02/21 16:59