Parte 1 102 Biologia applicata, Biotecnologie, Agroambiente Questo tratto genico è entrato 50 milioni di anni fa nella linea evolutiva che poi avrebbe dato origine ai placentati. Allo stesso modo i mitocondri, che erano dei batteri inglobati nella cellula, hanno ancora un po di DNA di origine batterica (DNA mitocondriale). La genomica comparata rivela che il trasferimento di geni da una specie all altra non è un evento raro né artificiale, ma è il modo in cui l evoluzione va avanti perché tutte le specie viventi sono fatte da composizione di materiale genetico di origine molto diversa. La genomica funzionale ricerca in modo sistematico la funzione di ogni gene. Per poter comprendere i processi fisiologici delle cellule ed in che modo insorgono malattie, viene analizzato l RNA e le proteine prodotti in un certo momento e in un preciso tessuto. Infatti, tutte le cellule hanno lo stesso materiale genetico, ma lo usano in maniera differenziale (un neurone e una cellula muscolare utilizzano batterie di geni diverse). Una tecnica prevede l utilizzo di chip, chiamati microarray, che sono delle lastrine (di 1,5 cm di lato) su cui vengono posizionate in maniera ordinata e nota, ad esempio, tutti i 20.000 geni umani sotto forma di corti oligonucleotidi [ 36 ]. la sequenza complementare, si legherà e darà un segnale fluorescente. Usando due colori diversi, si possono confrontare due popolazioni diverse e vedere la differenza di espressione. In questo modo si può confrontare una cellula normale e una cellula tumorale e vedere quali sono i geni importanti per lo sviluppo tumorale. Oggi le terapie con anticorpi monoclonali vengono utilizzate per curare alcune forme di tumori. Gli anticorpi monoclonali sono diretti contro un solo specifico antigene e sono capaci di individuarlo, legarlo e neutralizzarlo. Spesso l antigene utilizzato per l immunizzazione è una proteina espressa da DNA ricombinante. La decodificazione dell espressione genica oggi viene utilizzata per guidare la terapia e si chiama medicina personalizzata. Un altro esempio di genomica funzionale è l inattivazione dei geni. Questo permette di capire, a livello di un organismo, cosa fa un gene e cosa viene a mancare fenotipicamente se viene disattivato. Per fare questo occorre generare un organismo privo di quel gene: sono i famosi topolini knock-out. Utilizzando un vettore che porta una versione difettiva del gene d interesse, si inserisce questo vettore nelle cellule dell embrione e un meccanismo naturale, che è la ricombinazione omologa, scambierà il gene immesso con quello endogeno e si svilupperà un embrione di topolino mancante di quel gene. I topi knock-out oggi sono un modello per molti tumori e per numerose vie metaboliche. 1. Vengono estratti da una popolazione cellulare gli mRna che identificano quali geni sono espressi. 2. Vengono convertiti in DNA utilizzando la trascrittasi inversa. 3. Il DNA viene denaturato, rendendolo a singola elica. 4. Viene poi marcato con dei gruppi fluorescenti. In presenza di queste micropiastre, laddove l mRNA troverà FASE 1 Controllo 5 Campione 5 3 AAAAAAAAAA 3 AAAAAAAAAA + 5 + 3 5 TTTTTTTTTT T7- promoter oligo(dT)-promoter 3 5 TTTTTTTTTT T7- promoter oligo(dT)-promoter MMLV-RT MMLV-RT AAAAAAAAAA TTTTTTTTTT T7- promoter 3 estrazione del RNA e controllo di qualità 3 5 5 3 AAAAAAAAAA TTTTTTTTTT T7- promoter RNA polimerasi di T7 Cy5-CTP + NTPs 3 5 UUUUUUUUUU 3 5 sintesi della 1° e 2° elica di cDNA RNA polimerasi di T7 Cy3-CTP + NTPs 3 5 UUUUUUUUUU FASE 2 FASE 3 FASE 4 ibridazione e lavaggio del microarray scansione laser e lettura della uorescenza normalizzazione; ltraggio e analisi dei dati sintesi marcatura e puri cazione di cRNA antisenso 36 Un analisi dei profili tramite microarray può essere suddivisa in quattro fasi: 1. preparazione dei campioni e marcatura; 2. ibridazione e lavaggio; 3. acquisizione dei dati; 4. analisi dei dati. 0100.Parte1_Cap_03.indd 102 26/02/21 16:59