Le moderne biotecnologie Esistono anche metodi di marcatura non radioattiva, quali la biotina e la digossigenina, che danno substrati stabili più a lungo e più sicuri per l operatore. Si conoscono vari tipi di sonde. 1. Sonde cromosoma-specifiche. Si tratta di una sonda costituita da un insieme di sonde di DNA, ognuna delle quali è omologa all intero cromosoma considerato. L ibridazione con una sonda cromosoma-specifica viene marcata con un fluorocromo per visualizzare segnali fluorescenti su una determinata coppia di cromosomi omologhi lungo tutto il cromosoma. 2. Sonde centromero-specifiche. Questa sonda è costituita da un tipo di sequenze ripetute, dette alfoidi, presenti nei centromeri. La sua ibridazione marcata con un fluorocromo permette di visualizzare segnali fluorescenti a livello dei centromeri di una coppia di cromosomi omologhi. 3. Sonde telomero-specifiche. Sono costituite da sequenze localizzate nella parte terminale dei cromosomi e sono sequenze specifiche per il telomero di ogni cromosoma. L ibridazione con una sonda telomerica specifica, marcata con un fluorocromo, consente di visualizzare segnali fluorescenti a livello dei telomeri di uno dei due bracci di una coppia di cromosomi omologhi. 4. Sonde locus-specifiche. La sonda locus-specifica è costituita dalla sequenza di una regione delimitata lungo uno specifico cromosoma e la sua ibridazione, con tale sonda marcata con un fluorocromo, permette di visualizzare segnali fluorescenti a livello di una regione sul braccio corto o sul braccio lungo di una coppia di cromosomi omologhi [ 35 ]. Le sonde di DNA marcate possono essere utilizzate per monitorare su fase solida (membrane di nitrocellulosa, nylon) la presenza in una popolazione CROMOSOMAeterogenea di uno specifico frammento SONDA SPECIFICA di DNA (Southern blotting) o di RNA (Northern blotting) o le proteine (Western blotting). I frammenti degli acidi nucleici sono CENTROMEROtrasferiti su gel di agarosio o di poliaSONDA SPECIFICA crilamide dopo essere stati precedentemente separati tramite elettroforesi. 101 Capitolo 3 Il Southern blotting è sfruttato principalmente per analizzare nel dettaglio la struttura di un gene, a partire cioè da pochissime molecole di un campione di DNA genomico. Il Northern blotting è utilizzato per lo studio dell espressione genica, cioè per capire quali geni vengono trascritti: l RNA viene estratto e purificato da cellule o tessuti e poi analizzato per determinare la presenza o assenza di una certa sequenza. Il Western blotting è una tecnica mediante la quale una molecola, all interno di una miscela di proteine separate elettroforeticamente, è successivamente riconosciuta in genere tramite metodi immunologici. Genomica La possibilità di sequenziare interi genomi ha aperto la strada alla genomica che è l insieme di discipline che studiano nel complesso tutti i geni di un organismo. Essa si distingue in genomica comparata e genomica funzionale. La genomica comparata paragona i genomi di organismi diversi per stabilirne le relazioni evolutive o per capire quali sono i geni conservati e quindi importanti per la vita. Ad esempio il genoma umano paragonato a quello di altri organismi è risultato per circa il 40% di origine virale: si tratta di sequenze di DNA derivate da virus o retrovirus, che nel corso dell evoluzione (anche parecchi milioni di anni fa), sono entrate nella linea germinale umana e vi sono rimaste. Alcune di queste informazioni sono molto importanti, ad esempio la placenta ha come componente fondamentale una proteina che si chiama sincitina che è una proteina di un retrovirus. Librerie genomiche cromosoma-specifiche Sequenze alfoidi cromosoma-specifiche TELOMEROSONDA SPECIFICA Sequenze subtelomeriche cromosoma-specifiche LOCUS-SONDA SPECIFICA Cloni genomici regione-specifici LIBRO DIGITALE L impronta genetica GLOSSARY Tecniche di ibridazione Hybridization techniques Genomica Genomic 0100.Parte1_Cap_03.indd 101 35 Visualizzazione delle diverse sonde molecolari specifiche. Il giallo-verde identifica dove viene localizzato il segnale fluorescente dovuto all ibridazione della sonda sul cromosoma. 26/02/21 16:59