Parte 1 100 Biologia applicata, Biotecnologie, Agroambiente Ibridazione di acidi nucleici Le tecniche di ibridazione permettono non solo di identificare e quantificare sequenze specifiche di DNA e di RNA, ma di studiarne l organizzazione, la localizzazione intra-cellulare e l espressione. Per determinare la presenza e la quantità di acidi nucleici si usa una sequenza specifica detta sonda molecolare, o probe, corrispondente al DNA bersaglio nel campione biologico analizzato. Le sonde possono essere corte (20-30 oligonucleotidi) o lunghe (2-3 kb). Le tecniche di ibridazione consistono nell appaiamento di molecole a singolo filamento provenienti da due fonti diverse (il DNA bersaglio e la sonda) e permettono di identificare all interno di un gel i frammenti di DNA che sono complementari a una determinata sequenza [ 34 ]. Innanzitutto il DNA deve subire un processo chiamato denaturazione che consiste nella separazione della molecola di DNA in due filamenti singoli. Questo processo si verifica quando una soluzione acquosa di DNA è riscaldata a 100 °C o esposta a un pH molto alto (>13) o sono presenti sostanze come urea o formamide che rompono i ponti a idrogeno che normalmente tengono insieme i due filamenti della doppia elica. Poiché la denaturazione è un processo reversibile, se dopo la separazione delle eliche si fa scendere gradualmente la temperatura a 65 °C o si varia il pH, i singoli filamenti si possono riappaiare e la doppia elica può riformarsi. Il processo è chiamato rinaturazione del DNA. Allo stesso modo si possono avere reazioni anche fra due catene di DNA a singolo filamento di diversa origine, purché abbiano sequenze nucleotidiche complementari e si possano formare delle doppie eliche di DNA-RNA o RNA-RNA. Questo processo prende il nome di ibridazione e il risultato è definito ibrido molecolare. La condizione fondamentale perché ciò avvenga è che in soluzione si mettano molecole di DNA a singolo filamento antiparallele con sequenza complementare, cioè delle sonde. L ibridazione è una forma di riconoscimento molecolare estremamente specifica e la sonda è in grado di trovare fra moltissime sequenze proprio, e solo, quella complementare. Le sonde, inoltre, devono essere rilevabili e a tal fine vengono marcate con sostanze fluorescenti o con isotopi radioattivi come zolfo 35 (35S) e fosforo 32 (32P) che sono i più usati in biologia molecolare. I segnali emessi dai radioisotopi si rilevano attraverso: 1. la tecnica dell autoradiografia, che sfrutta la capacità degli isotopi radioattivi di impressionare le lastre fotografiche; 2. il contatore geiger, che misura gli ioni prodotti in un gas da particelle o da raggi emessi da un radioisotopo; 3. il contatore a scintillazione, entro il quale un campione radiomarcato è mescolato con un liquido che contiene un liquido fluorescente capace di emettere luce quando assorbe l energia delle particelle o dei raggi durante il decadimento radioattivo. Campione da analizzare Sonda molecolare Con miscela eterogenea di frammenti di acido nucleico (omoduplex) Con sequenze note di acido nucleico o oligonucleotidi sintetici DNA bersaglio Denaturazione Miscela di sonda e campione Rinaturazione Acidi nucleici riappaiati nel campione Rinaturazione Eteroduplex sonda-sequenza bersaglio 34 Visualizzazione di eteroduplex sonda-bersaglio in un saggio di ibridazione di acidi nucleici. Un campione di interesse (consistente in una miscela complessa di acidi nucleici) e una popolazione predefinita di sonde (costituite da sequenze note di acido nucleico, o oligonucleotidiche allo stato di singolo filamento), vengono miscelati e lasciati appaiare. Le sequenze che in precedenza erano appaiate nel campione di interesse e nella sonda si riappaieranno tra loro per formare 0100.Parte1_Cap_03.indd 100 Rinaturazione Sonda riappaiata omoduplex (in basso a sinistra e a destra). Tuttavia, si formeranno anche nuove molecole di eteroduplex tra la sonda e le sequenze bersaglio che possiedono sequenze totalmente o parzialmente complementari a essa (in basso al centro). Le condizioni di ibridazione possono essere modificate per facilitare la formazione di eteroduplex. In questo modo, le sonde riconoscono e identificano selettivamente acidi nucleici correlati presenti in una popolazione complessa. 26/02/21 16:59