2  Le colture cellulari vegetali

Le prime piante a essere moltiplicate in vitro sono state specie ad alto valore commerciale come le piante ornamentali, soprattutto orchidee, ma oggi sono tante le piante di interesse agrario, come fragole, ortive, alberi da frutto ed essenze forestali di difficile moltiplicazione che vengono propagate con tale metodica.
La tecnica, detta anche micropropagazione, è relativamente semplice e consente di lavorare su materiale miniaturizzato in una situazione generale ottima per quello che riguarda le condizioni ambientali, i fattori nutrizionali, gli ormoni, l’assenza di parassiti vegetali e animali [  3  ].
Molteplici, infatti, sono i vantaggi delle colture in vitro che ci consentono di:
produrre piante omogenee, geneticamente identiche alla pianta madre. Dato che non derivano da riproduzione sessuale non vi è rimescolamento dei caratteri;
produrre un elevato numero di piante in qualsiasi stagione: il numero di piante complete che si possono sviluppare da un piccolo frammento nel giro di pochi mesi è elevatissimo e ciò comporta risparmio di tempo rispetto alle tecniche di propagazione tradizionale. Le piante, svincolate dai cicli naturali, possono essere moltiplicate in ogni periodo dell’anno;
eseguire manipolazioni genetiche, in quanto questa tecnica apre la strada alle manipolazioni genetiche delle piante superiori e consente di ottenere un modello di sviluppo diverso della pianta allevata normalmente;
approfondire le conoscenze scientifiche poiché la disponibilità di colture di cellule o di organi isolati ha permesso di osservare più facilmente le proprietà del ciclo cellulare nonché la fisiologia, la biochimica e la genetica delle piante. È grazie al comportamento delle cellule in coltura che si è evidenziato il ruolo degli ormoni vegetali nella formazione degli organi (auxine per la produzione di radici, citochinine per quella dei germogli, ecc.);
migliorare la ricerca fitopatologica in quanto è possibile indagare sulla penetrazione e replicazione dei virus, sulla coltivazione di parassiti obbligati, sulle interazioni ospite-parassita, nonché effettuare test per fitotossine e studi sulle nodulazioni, ecc.

     Tecnica delle colture vegetali in vitro
La rigenerazione delle piante in vitro avviene in tre momenti distinti.
I primi due si svolgono in condizioni particolari di asepsi (sterilità) dell’ambiente di incubazione e del mezzo nutritivo  4  ].

Fase di prelievo Il prelievo delle parti di pianta deve avvenire in condizioni di assoluta sterilità per evitare che eventuali microrganismi dell’ambiente, la cui velocità di crescita è molto superiore a quella delle piante, entrino in competizione per il nutrimento con la pianta da coltivare.
Le operazioni di prelievo devono essere eseguite in ambiente sterile e perciò ci si avvale di strumenti quali: cappa a flusso laminare sterile, autoclave a pressione, sterilizzatore per pinze e bisturi. Nel vaso di coltivazione deve essere presente un solo tipo di organismo vegetalecioè quello che si vuole coltivare.

Fase di moltiplicazione La coltura vera e propria ha inizio quando il prelievo viene inserito sul mezzo nutritivo entro contenitori in vetro di vari tipi: vasetti da 500 cc tondi o allungati, scatole petri, provette [  5  ].
La composizione del mezzo nutritivo è diversa da coltura a coltura e può essere in forma liquida o gelatina.
I costituenti minimi sono i sali inorganici, uno zucchero (di solito il saccarosio), una o più vitamine, acqua deionizzata o distillata, amminoacidi e additivi ormonali (in particolare auxine e citochinine). Per solidificare i mezzi nutritivi il prodotto più usato è l’agar-agar.
La coltura di tessuti vegetali avviene in sale di coltura o di vegetazione con luce e temperatura controllate.
Il fotoperiodo, l’intensità e il tipo di luce giocano ruoli fondamentali nello sviluppo delle piante, mentre la temperatura influisce sulla velocità di crescita. Normalmente il fotoperiodo è di 18 ore di luce e 6 ore di buio, l’intensità luminosa media è di 2.500 lux, la temperatura ottimale è di 22-24 °C.

Fase di ambientamento Terminata la fase nel laboratorio, le piantine radicate in vitro lasciano l’ambiente asettico per essere poste in serra [  6  ]; esse, infatti, non possono ancora essere piantate direttamente in campo, dove morirebbero in breve tempo perché ancora troppo delicate.
Per la fase intermedia, di ambientamento in serra, le piantine vengono trapiantate in vasetto o in contenitori alveolati su un substrato di torba e di agriperlite. È un periodo di 25-40 giorni in cui le piantine “imparano” a vivere in un ambiente normale per poi essere pronte a essere piantate in campo.

     Classificazione delle colture in vitro
Le colture in vitro possono essere classificate in base al tipo di organizzazione cellulare o in base al tipo di materiale vegetale utilizzato.
Secondo il tipo di organizzazione cellulare distinguiamo le seguenti tipologie.
1. Colture organizzate - sono simili alla propagazione vegetativa in vivo, con tagli, divisioni, sviluppo di gemme ascellari e germogli. Se la coltura è tecnicamente ben eseguita, le piante ottenute sono perfettamente identiche alla pianta di partenza.
2. Colture non organizzate - cellule o tessuti isolati da parti organizzate già differenziate della pianta, vengo no stimolati a “sdifferenziarsi” e a moltiplicarsi in forma indifferenziata, di solito sotto forma di tessuto calloso, su terreni di coltura con alte dosi di auxine e di citochinine.
La stabilità genetica è spesso molto bassa.
3. Coltura organizzata o non-organizzata - ha caratteristiche intermedie fra le prime due. Da organi o tessuti si creano con opportune tecniche, tessuti callosi indifferenziati che, coltivati e stimolati, danno origine nuovamente a organi (radici, germogli) o a piante complete (pro-embrioni o embrioni).
La progenie può presentarsi diversa dalla pianta madre originaria. Secondo il tipo di “materiale” vegetale abbiamo: protoplasti, piante intatte, semi, organi, espianti, tessuti, cellule che esamineremo di seguito in maniera dettagliata.

     COLTURA DI PROTOPLASTI
È una tecnica conosciuta fin dal 1930 e consente di far crescere in vitro singole cellule derivate da vari organi della pianta, sfruttando la caratteristica tipica dei vegetali di poter passare da cellule differenziate a cellule indifferenziate.
Essere riusciti ad isolare protoplasti vitali capaci di rigenerare piante complete ha aperto nuove strade alla ricerca scientifica e tecnologica. La produzione e l’utilizzo di protoplasti avviene con le seguenti fasi [  7  ].
1. Il tessuto vegetale, sterilizzato, viene sottoposto all’azione di enzimi cellulasi per rimuovere le pareti di cellulosa delle cellule vegetali.
2. Si separano i protoplasti che, privi della parete rigida, assumono forma sferica.
3. Dopo alcune ore i protoplasti cominciano la ricostruzione della parete, terminata la quale si dividono per mitosi.
4. Da ogni singolo protoplasto si ottiene un aggregato di cellule detto callo 8  ]. Il callo è formato da cellule indifferenziate che hanno perso la forma e la funzione originali e possono moltiplicarsi indefinitamente. Dal callo, opportunamente trattato con dosaggi di ormoni e di nutrienti aggiunti al terreno di coltura, si ottiene una pianta simile a quella di partenza.
5. Il processo di rigenerazione in un callo può dare origine a un embrione (embriogenesi somatica), come succede per le colture in vitro di carota, o ad organi (organogenesi somatica), come nel tabacco in cui, a seconda dei dosaggi ormonali, si ha lo sviluppo di radici o di germogli.
La pianta ottenuta è sempre un clone della pianta madre e il processo prende il nome di clonazione.

     COLTURA DI PIANTE INTATTE (SEMI DI ORCHIDEE)
La coltura di piante intatte è simile, nei princìpi, a quella naturale e può avvenire sia per seme sia per propagazione [  9  ].
Viene effettuata per quelle specie che in ambiente naturale trovano difficoltà a riprodursi, come le orchidee, il cui sviluppo dipende dall’attività di una micorriza. In vitro la funzione della micorriza è sostituita da un’opportuna nutrizione costituita da un substrato a cui si aggiunge tiamina, inositolo, latte di cocco e frullato di banane.
Su di esso si fa cadere la peluria, interna al baccello, contenente i semi. Il ciclo di allevamento viene accorciato tanto che nel giro di due o tre mesi si ottiene un numero elevatissimo di piantine.

     COLTURA DI EMBRIONI
Dopo la rimozione del rivestimento del seme e il taglio trasversale dei cotiledoni si coltiva in vitro l’embrione.
Questa tecnica viene adottata per superare il grave problema dell’impoverimento, a seguito della selezione per il miglioramento genetico, del germoplasma delle specie coltivate e per recuperare quei caratteri, come resistenza ai parassiti, alla siccità ecc., che solo le specie selvatiche o quelle ad esse affini possiedono ancora. Inoltre, fenomeni di incompatibilità polline-stimma, endosperma difettosi, aborto dell’embrione non consentono di attuare in natura gli incroci tra specie selvatiche e coltivate.
Tali problemi vengono superati utilizzando le colture di embrioni e l’impollinazione e la fecondazione in vitro.
Numerosi sono gli esempi con risultati soddisfacenti: l’ibrido fra fagiolo comune e Phaseolus acutifolius possiede la tolleranza alla batteriosi Xanthomonas phaseoli [  10  ]; l’incrocio fra Lycopersicum esculentum e Lycopersicum peruvianum resiste al virus del mosaico, quello tra Cucurbita pepo e Cucurbita ecuadoriensis fornisce una zucchina resistente, come la zucchina selvatica, a numerose virosi.
La coltura di embrioni permette anche di accorciare il ciclo di allevamento, di produrre piante aploidi ed è fonte per la formazione di callo [  11  ].

     COLTURA DI GERMOGLI, APICI VEGETATIVI, ESPIANTI, CALLI, SINGOLE CELLULE
È la tecnica più diffusa per ottenere un elevato numero di piante in tempi brevi (clonazione). L’epoca migliore per il prelievo dei germogli è quello che coincide con il periodo di massima vegetazione della pianta [  12  ], ma può essere utilizzato anche materiale dormiente. In relazione al tipo di taglio si parla di coltura di germogli, di apici vegetativi, di espianti.
La coltura di callo si ha quando un tessuto differenziato produce un nuovo tessuto indifferenziato e si ottiene a seguito del taglio di un organo: ne è un esempio il callo ottenuto da frammenti di foglia di Saintpaulia o di Anthurium.
Le cellule si coltivano con l’aiuto di enzimi o di tecniche meccaniche. Durante la fase di moltiplicazione si selezionano, in assoluta asepsi, microtalee che vengono piantate in vitro. 
     COLTURA DI MERISTEMI
Si esegue per fini di prevenzione fitosanitaria; i meristemi infatti sono gli unici tessuti della pianta esenti da virosi e, quindi, consentono di ottenere piante sane [  13  ].
La fase di prelievo viene condotta al microscopio sotto cappa a flusso laminare e consiste nell’espianto di un gruppo di cellule meristematiche da una gemma. È la tecnica d’elezione per la fragola e la patata, colture facilmente soggette ad attacchi virali.

     COLTURA DI ANTERE E DI OVARI
La tecnica delle colture in vitro di antere o di ovari immaturi nacque dall’idea di poter meglio sfruttare le mutazioni positive che si verificano in alcuni geni o cromosomi.
Il rimescolamento genetico derivato dalla fusione dei gameti maschili e femminili, infatti, se da una parte rappresenta una fonte di variabilità genetica, risorsa principale dell’evoluzione e protezione dell’organismo da mutazioni dannose, dall’altra rende difficili l’individuazione e l’isolamento dei mutanti utili. Lo stato diploide delle piante, inoltre, rende il miglioramento genetico tradizionale lungo e laborioso e si calcola che con l’autofecondazione siano necessarie almeno 5-6 generazioni per ottenere la completa omozigosi dei caratteri. Colture di cellule e intere piante aploidi facilitano l’isolamento di mutanti e le tecniche di incrocio e selezione, poiché le mutazioni utili non vengono mascherate dalla copia del gene normale. L’utilità di tali piante è stata descritta fin dai primi anni del ’900, ma il loro uso era limitato ai casi di aploidia spontanea, soprattutto nel frumento e nel mais.
Nel 1966 fu scoperta accidentalmente e descritta la rigenerazione di piante aploidi da colture di polline in vitro e oggi tale tecnica è stata realizzata per oltre un centinaio di specie vegetali tra cui il tabacco, l’orzo, la vite, il mais, il frumento, la patata, il riso. Di queste due ultime colture sono in circolazione varietà migliorate che derivano da piante aploidi. Il riso, in particolare, ha foglie più grandi e un peso in sostanza secca di circa il doppio del normale.
Fra le colture ortive sono stati particolarmente studiati l’asparago e la melanzana.
La tecnica consiste nei seguenti passaggi:
1. Le antere immature vengono sottoposte a un trattamento a freddo per alcuni giorni, variabile a seconda della specie.
2. Dalle antere vengono espiantate le microspore allo stadio mononucleato.
3. Le microspore vengono trapiantate in terreno di coltura.
4. Si forma un callo da cui si sviluppa la piantina.
5. A volte il callo viene trapiantato in un nuovo terreno di coltura povero di auxine e di saccarosio [  14  ].
Quando si vogliono ottenere piante diploidi, dopo aver identificato la mutazione utile, si può stimolare in vitro la duplicazione dei cromosomi utilizzando un farmaco, la colchicina.
Si genera così una pianta fertile come una pianta normale in cui entrambe le copie di tutti i geni sono identiche.
Una tecnica simile si utilizza nelle colture degli ovari immaturi anche se, per il momento, è risultata meno efficiente della coltura di antere.
Molto recentemente si è messa a punto tale tecnica per la cipolla: considerando che questa specie è allogama e biennale, e richiede lunghi tempi per conseguire un accettabile livello di omozigosi, l’induzione in vitro di aploidi apre nuove prospettive per il suo miglioramento genetico.

FOCUS

TRASMISSIONE E CONTROLLO DEI VIRUS
I virus si possono trasmettere da pianta a pianta per contatto, per seme, per polline, per propagazione vegetativa, per mezzo di funghi e per vettori animali. Poiché le malattie virali non sono curabili con trattamenti in campo, l’unico modo per controllarle è la prevenzione. Il risanamento di piante infette prevede la coltura di meristemi apicali nei quali le particelle virali sono assai rare.

NUOVE Biotecnologie Agrarie e Biologia Applicata
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