Indagine dei componenti molecolari
I cristalli delle grosse molecole che si trovano nelle strutture cellulari vengono esplorati attraverso il difrattometro, strumento a raggi X, e la tecnica usata prende il nome di difrattometria.
La natura dei vari componenti della cellula si analizza con la tecnica del frazionamento: le cellule vengono prima “rotte” con mezzi meccanici o chimici e poi poste in appositi strumenti chiamati centrifughe che, ruotando a fortissima velocità, separano le varie componenti in base alle loro dimensioni e forme e quando sono stratificati su una soluzione di saccarosio al 5-20%: a 800 g per 10 min sedimentano i nuclei; a 15.000 g per 10 min del sopranatante sedimentano mitocondri, lisosomi e perossisomi; a 100.000 g per 60 min del sopranatante sedimentano i frammenti di membrana e del reticolo endoplasmatico; la centrifugazione del sopranatante a 200.000 g per 3 ore fa sedimentare i ribosomi.
Il campione contenente componenti subcellulari, come lisosomi, perossisomi e frammenti di membrana, è posto in provette che sono inserite in un anello di fori cilindrici disposti su un rotore metallico che, muovendosi rapidamente, genera enormi forze centrifughe in grado di provocare la sedimentazione delle particelle.
Poiché il rotore è sotto vuoto, non si crea attrito e si impedisce il riscaldamento. Un sistema di refrigerazione mantiene il campione a 4 °C. Un’ulteriore purificazione dei vari componenti si ottiene mediante la centrifugazione in gradiente di densità in cui gli organuli vengono separati per sedimentazione attraverso un gradiente di una sostanza densa come il saccarosio.
Un altro metodo per separare le singole sostanze consiste nello sfruttare le loro diverse proprietà chimico-fisiche attraverso la cromatografia o l’elettroforesi [ 2 ].
L’elettroforesi su gel consente di separare e analizzare molecole di DNA di dimensioni diverse. Molecole cariche, come acidi nucleici e proteine, possono essere separate mediante elettroforesi (migrazione in un campo elettrico).
Essendo cariche negativamente, le molecole di DNA migrano verso il polo positivo. In una matrice porosa la velocità di migrazione del DNA è inversamente proporzionale al LOG10 della sua lunghezza.
Al termine dell’elettroforesi, DNA di lunghezza diversa sono risolti in bande distinte. Attraverso questa stessa tecnica si determinano le dimensioni e la composizione in subunità di una proteina, mentre per identificare una particolare proteina in una miscela di proteine si ricorre all’utilizzo della corsa elettroforetica su gel di un anticorpo specifico primario e di uno secondario coniugato con un enzima che rivela un segnale colorimetrico. Questa tecnica si chiama western blotting o immunoblotting. Con tecniche simili si analizzano frammenti di DNA (Southern blotting) o di RNA (Northern blotting).
I marcatori usati comunemente comprendono fluoresceina o rodamina (per la microscopia a fluorescenza), l’enzima perossidasi di rafano (per la microscopia ottica convenzionale o per la microscopia elettronica) e l’enzima fosfatasi alcalina o perossidasi (per la rivelazione biochimica).
Un altro metodo indispensabile per marcare le molecole biologiche è l’uso di radioisotopi. In questi elementi, detti anche isotopi radioattivi, il nucleo è instabile e subisce degradazioni nel corso delle quali vengono emesse particelle subatomiche provviste di energia come gli elettroni (particelle β) o radiazioni come i raggi γ. Per sapere se una molecola è stata radio marcata si misura la sua attività specifica con lo scintillatore e si analizza la quantità di radioattività per unità di materiale, valutata in quantità di degradazioni per millimoli al minuto. Le molecole marcate con radioattivo possono essere evidenziate con l’autoradiografia, tecnica che si usa anche per scoprire il movimento delle sostanze dentro la cellula. Le radiazioni emesse impressionano una lastra speciale formando aree più scure che indicano la localizzazione della sostanza. Lo studio delle interazioni cellulari e delle proprietà dei tessuti si evidenzia con le colture di cellule in vitro.