Il compito di danneggiare il DNA non è affidato ad agenti chimici o fisici, ma a specifiche proteine che “leggono” tutto il genoma e tagliano nel punto desiderato. Sono enzimi nucleasi appositamente sintetizzati in laboratorio e noti anche con il nome di “forbici molecolari”.
Al momento sono disponibili quattro tipologie di gene editing basate su nucleasi: le ZFN (Zinc finger nucleases), le TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nucleases), il CRISPR/CAS SYSTEM ispirato a un meccanismo batterico di difesa contro i virus e le MEGANUCLEASI. Queste ultime, scoperte verso la fine degli anni Ottanta, sono enzimi comunemente presenti nei batteri e capaci di riconoscere e tagliare sequenze molto ampie di DNA che, prima di essere usate, devono essere sottoposte a un lento e costoso processo di manipolazione in grado di adattarle al compito richiesto.
Le ZINC FINGER, letteralmente “dita di zinco”, sono tecniche che si svilupparono a partire dal 1994. Si tratta di enzimi di restrizione artificiali creati fondendo un atomo di zinco con piccole strutture proteiche capaci di agganciarsi e tagliare il DNA. Con questa tecnica nel 2002 fu modificato il genoma di un organismo pluricellulare come il moscerino della frutta, cui seguirono modifiche genomiche del pesce, del ratto e del mais. Le TALEN sono enzimi di re- strizione artificiali con cui sono stati modificati in vitro anche il genoma del lievito e quello delle cellule umane. Sono più precise e affidabili delle dita di zinco, ma anch’esse non sono infallibili. Entrambe queste tecniche richiedono infatti l’ingegnerizzazione e la sintesi di proteine personalizzate per ogni sequenza target di DNA e possono fornire risultati di qualità variabile o incompleti.
Il sistema CRIPSR/Cas9 fu reso noto nel maggio del 2012 con la pubblicazione dello studio di Emmanuelle Charpentier e Jennifer Doudna, che segnò una svolta dell’ingegneria genetica perché sosteneva che qualunque tipo di cellula vegetale, animale, inclusa quella umana, può essere modificato geneticamente e corretto direttamente là dove si trova senza doverne fornire una copia sana dall’esterno.
Le modifiche possono avvenire anche per un singolo e minimo errore, in ogni parte del genoma. Questo sistema è stato originariamente scoperto nei batteri, nei quali agisce come difesa contro i virus, e si basa sulla combinazione di due elementi: la proteina Cas9, che codifica enzimi capaci di tagliare il DNA, e un RNA che si appaia al DNA per indicare all’enzima Cas il punto preciso in cui tagliare. In pratica, Cas9 può essere diretta verso una qualunque sequenza del DNA purché essa contenga alcune basi che servono da ancoraggio all’enzima e definiscono una sequenza detta PAM (Protospacer Adjacent Motif).
Poiché la Cas9 si associa a corte sequenze di RNA che sono capaci di appaiarsi con il DNA da tagliare, il processo non risulta casuale e a guidare l’enzima sulla sequenza bersaglio non è più una proteina, ma un filamento di RNA chiamato “guida” o sgRNA facile da sintetizzare e molto economico.
La riparazione del taglio si affida a un sistema di riparazione del DNA chiamato “ricombinazione omologa”, (scambio di informazione genetica fra molecole omologhe di DNA.) che ogni cellula possiede.